绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆
生物制药 2010级洪琰 3100703001
生物制药 2010级林轩圣 3100703005
生物制药 2010级陈艳 3100703006
生物制药 2010级李文敏 3100703007
生物制药 2010级王卉 3100703047
摘要：
本实验主要研究绿色荧光蛋白（GFP）的在体外细菌的基因克隆，通过PCR扩增目的基因，限制酶切割目的基因与载体，构建连接重组体，转入受体细胞筛选重组体、等步骤诱导绿色荧光蛋白在克隆菌中的克隆。

关键词绿色荧光蛋白 GFP 基因表克隆
1 前言
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。

分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。

其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。

绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。

在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。

这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。

2 实验目的
研究绿色荧光蛋白基因在DH5→克隆菌中的表达
3 实验原理
3.1高纯质粒小量制备
3.2获取外源基因（PCR）
3.3构建从组DNA（T连接）
3.4从组DNA的转化
3.5从组DNA的筛选（蓝白斑）
3.6从组DNA的鉴定（酶切）
4 实验设备
超净工作台；
恒温摇床；
高压灭菌锅；
恒温培养箱；
台式高速离心机；
大容量冷冻离心机；
PCR仪；
紫外分光光度计；
水平电泳槽；
垂直电泳槽；
电泳仪；
微波炉；
凝胶成像系统；
制冰机；
超低温冰箱；
微量加样枪（10μl，100μl，1000μl）
5 实验材料
5.1材料
质粒：pEGFP-N1；
T载体：pUCm-T；
菌种：DH5 (克隆菌)；
PCR引物：
F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA
R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC
Tm=56p
5.2试剂：
UCm-T Vector （碧云天）；
快速DNA连接试剂盒（碧云天）；
两种限制性内切酶：EcoR I, Hind III（Fermentas）；
质粒提取试剂盒（百泰克或BioEASY）；
抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)；
X-gal、IPTG等
6 实验操作步骤
6.1高纯质粒的小量制备
(材料中已经制备完毕)
6.2获取外源基因
（1）PCR反应体系设置
取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：
H2O 6μl
质粒DNA（pEGFP-N1）2μl
引物GFP1 (10μM) 1μl
引物GFP2 (10μM) 1μl
Premix Taq 10μl
总体积20μl
如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上.
PCR仪操作
步骤操作
PCR参数设置①94℃预变性5分钟后开始以下循
环
②94℃30 秒
56℃30 秒
72℃ 1 分钟
③72℃7 分钟
④ 4 ℃保温
30个循环，共计约1小时50分钟
预热先不将PCR官插入模板，启动反应程
序
启动反应程序待温度升至94℃，按Pause键，暂停反
应程序，迅速将PCR管插入模板，盖
上盖子，再启动反应程序
（2）琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物
步骤操作
1、凝胶准备①称1g琼脂糖置三角瓶中，加0.5×
TBE 100ml ；
②微波炉加热大约2分钟，熔
化琼脂糖；
2、胶床准备①将梳子垂直插入到胶床的小凹槽
内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；
②将胶床放在调整好的水平台
上；
3、铺胶将冷却至60℃的凝胶加入 5
l10mg/ml溴化乙锭溶液(EB,剧毒)倒入
准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；
4、室温下静置凝胶固化室温下静置凝胶固化。

将带凝胶的胶床
置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负
极；
5、加入缓冲液向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲
液，越过凝胶表面即可；
6、拔出梳子轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；
7、样品准备样品准备：向核酸样品中加入约为样品
体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻
混匀；
8、上样用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶
的样品孔中，加样量为6 µl ；
9、开始电泳盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；
10、电泳条件电泳条件：电压80~120v，时间20～30
分钟；
11、电泳结束电泳结束后，切断电源，取出凝胶。

12、结果分析电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电
泳条带
13、观察结果，拍照取出凝胶，置于凝胶成像仪中拍照，观
察结果。

6.3构建重组DNA（T连接）
步骤操作
连接体系设置将下列溶液依次加入一个无菌的Eppendorf管，充
分混匀
T载体0.5μl
待插入片段 1.5μl
快速连接缓冲液(2X) 5.0µl
双蒸水或MilliQ水 2.5µl
Rapid T4 DNA ligase 0.5µl
总体积10µl
连接反应16℃反应45min
产物保存冷却后直接取5-10μl用于转化
6.4重组DNA的转化
（1）感受态细菌的制备（CaCl2法）
步骤操作
1、细菌小量培养挑取一DH5 单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养
2、扩大培养取其中500 l菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃
振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间
3、实际细菌取50ml菌液置于离心管内，4 ℃4500g离心5分钟
4、CaCl2处理加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴
30分钟
4℃4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷
CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞
悬液。

5、感受态细胞的收集和分装感受态细胞分装成100μl的小份，暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。

取其中一份进行转化
（2）DNA转化
步骤操作
1、冰浴取制备好的感受态细胞100μl,在冰浴中加入10μl酶连产物，
轻轻混匀，冰上静置30min；
2、热击转化产物42℃水浴中热击90s后，冰上放置2min；
3、复苏加入800μlLB液体培养基，37℃，100-180r/min荡培养45min
4、涂板培养取100μl悬浮细胞涂布在含氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)，
X-gal、IPTG的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正
放30min后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h
6.5重组DNA的筛选（蓝白斑）
步骤操作
挑选从LB平板上挑选一白色单菌落
接种接种于4mlLB/Amp培养液中
培养恒温摇床37℃振荡过夜培养
6.6重组DNA的鉴定（酶切）
（1）提取质粒DNA
步骤操作
1、收集细胞将1.5ml培养液移至EP管中，9000r/min离心30s,弃上清液，将
管倒置于卫生纸，使液体流尽
2、重悬浮细胞加入250μl溶液P1，漩涡振荡使菌体沉淀重悬浮
3、裂解加入250μl溶液P2，温和地上下翻转EP管6-10次使菌体充分
裂解，直到溶液变得清纯
4、复性加入400μl溶液P3，立即温和地上下翻转EP管6-10次使混匀，
室温放置5min
5、离心13000r/min离心10min，小心取上清液
6、上柱将吸附柱AC放于收集管中，向吸附柱AC中加入步骤（5）收
集的上清液，13000r/min离心1min，弃滤液
7、漂洗加入500μl去蛋白液PE，13000r/min,离心1min,弃滤液，重复
该操作1次，然后空柱13000r/min离心2min，室温放置5min 8、收集取出吸附柱AC放入一个新的EP管中，在吸附柱底部吸附膜的
中间部位加入70μl缓冲液EB，室温放置1min，13000r/min离
心10min，洗脱DNA，收集洗脱液
9、保存-20℃保存备用
（2）质粒DNA的酶切分析
步骤操作
1、酶切体系设在一个洁净的离心管中混匀下列反应物，充分混匀
定H2O 6 µl
10×M 酶切缓冲液 2 µl
质粒DNA 10 µl (500~1000ng)
Hind III 1 µl
EcoR I 1 µl
总体积20μl
2、酶切反应37℃水浴2h
3、电泳鉴定向酶切产物中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻
轻混匀,进行电泳鉴定（用原提取的质粒DNA作对比）
7 结果及计算
8 注意事项
9 参考文献
附录。