葡萄糖生物传感器的制备和应用

葡萄糖生物传感器的制备和应用

一、实验目的

学习和掌握国内外数据库查询综合运用的方法。

二、实验方法原理

由于葡萄糖测定在医疗诊断、发酵工业中占有相当重要地位, 如何快速准确地测定这一问题一直是重要的研究课题，所以葡萄糖传感器是生物传感器领域研究最多、商品化最早的生物传感器。通过图书馆馆藏数据库，掌握国内外数据库查询综合运用方法，查找与本实验相关的资料信息，初步了解生物传感器的原理，应用以及发展。找出自己感兴趣的葡萄糖生物传感器的制备方法，设计实验方案。

三、实验步骤

1、进入华南农业大学图书馆主页，点击网络数据库，如CNKI期刊、博士、硕士论文全文库等，进入检索界面。

2、分析实验题目，确定检索主题词，编写检索式。

3、查询生物传感器的原理，应用及发展。

4、查询葡萄糖生物传感器设计原理、制作步骤、性能测试指标。

5、以一种感兴趣的方法设计实验方案，写出能进行实验的报告。

四、结果处理

1、生物传感器的原理：

(1)生物功能物质的分子识别：生物传感器的原理以生物功能物质的分子识别为基础。例如，酶是一种高效生物催化剂，其比一般催化剂高106～1010倍，且一般都在常温常压下进行。此外，酶还具有高度的专一性(它只对特定物质进行选择性催化)。酶催化反应可表示为：

酶+底物酶·底物中间复合物—→产物+酶形成中间复合物是其专一性与高效率的原因所在。由于酶分子具有一定的空间构型，只有当作用物的结构与酶的一定部位上的构型互相吻合时，它才能与酶结合进而受酶的催化。酶的分子空间构型是它进行分子识别的基础。图1表示酶的分子识别功能。抗体的分子识别功能与酶类似。细胞器、微生物及动物组织等是分子集合体，结构比较复杂，其识别功能亦复杂。

图1 酶的分子识别功能

(2)生物传感器工作原理：按照受体学说，细胞的识别作用是由于嵌合于细胞膜表面的受体与外界的配位体发生了共价结合，通过细胞膜通透性的改变，诱发了一系列电化学过程。膜反应所产生的变化再分别通过电极、半

图2 生物传感器原理

导体器件、热敏电阻、光电二极管或声波检测器等转换成电信号，如图2所示。生物传感器的结构是多种多样的，但一般都是由固定化“功能”物质与传感器组合而成。

2、生物传感器应用：生物传感器广泛地使用于环境监测、生物化学分析、临床检验、军事医学等领域。酶、微生物和组织传感器等催化型传感器一般可以连续地检测mmol-umol 范围内相应的代射物的变化；抗体（或抗原）、外源性凝集素、受体及核酸传感器等亲和型传感器则被用作检测umol-pmol含量范围的激素、甾体、药物、微生物毒素、癌症标志物及病毒。近年来利用抗体或DNA/RNA探针制作的传感器通过酶的放大作用可检测到pmol-amol数量级的样品成分。

3、生物传感器发展：1962 年Clark 和Lyons 首次把嫁接酶法和离子敏感氧电极技术结合, 创制了测定葡萄糖含量的酶电极, 开创了生物传感器的先河。5 年后Updike 和Hicks 制成了固定化酶电极———这是生物传感器的首次问世。70 年代相继出现了电流型和电位型微生物电极、组织电极、线粒体电极。80 年代, 利用生物反应中的光效应、热效应、场效应和质量变化而开发的生物传感器蓬勃发展, 开始了生物电子学传感器的新时代。我国的生物传感器就始于这一时期:1988 年梁逸曾将其全面系统地介绍给了国内化学界。进入90 年代, 较大规模的研究工作在全国开展, 学术专著在近年也已出版10 余种, 每年有越来越多的研究报告发表。虽然我国生物传感器某些研究项目处于国际领先地位, 但目前国内尚无真正商品化生物传感器面市, 总体研究水平与国际上还有一段差距。

到目前为止, 生物传感器大致经历了 3 个发展阶段: 第一代生物传感器是由固定了生物成分的非活性基质膜( 透析膜或反应膜) 和电化学电极所组成; 第二代生物传感器是将生物成分直接吸附或共价结合到转换器的表面, 而无需非活性的基质膜,测定时不必向样品中加入其他试剂; 第三代生物传感器是把生物成分直接固定在电子元件上, 他们可以直接感知和放大界面物质的变化, 从而把生物识别和信号的转换处理结合在一起。

生物传感器的发展前景将十分广阔，主要表现为以下三个方面。①微型化：实现生物传感器微型化有两条途径，一是采用微型半导体装置——场效应管(FETs)和超大规模集成电路，二是采用光电子技术和光导纤维;②多功能化：即研制能够同时测定多成分的生物传感器以及模拟味觉的传感器;③智能化：具有“传感”与“识别”的综合功能，即所谓智能生物传感器。

4、葡萄糖生物传感器设计原理：葡萄糖生物传感器的发展基于两个方面的技术基础:第一,葡萄糖是动物和植物体内碳水化合物的主要组成部分, 葡萄糖的定量测定在生物化学、临床化学和食品分析中都占有很重要的位置,其分析方法的研究一直引起人们的关注。特别是临床检验中对血糖分析技术的需求,促进了葡萄糖酶分析方法建立;第二,1954 年,Clark 建立了氧电极分析方法。1956 年又对极谱式氧电极进行了重大改进,使活体组织氧分压的无损

测量成为可能,并首次提出了氧电极与酶的电化学反应理论。根据Clark 电极论,自20 世纪60 年代开始,各国科学家纷纷开始葡萄糖传感器的研究。

5、葡萄糖生物传感器制作步骤：1992 年, Koopal 等将聚吡咯(PPy) 微管用于固定化GOD。其方法是通过模板合成法,将吡咯聚合在金属电极刻蚀膜上,接着,让GOD 牢固地吸附在聚咯微管内构成GODPPPy 传感器。所用的径迹刻蚀膜通常由聚酯和聚碳酸酯构成, GOD 在微管内保持生物活性。由于聚吡咯、聚噻吩等共轭的聚合导电物质能在径迹刻蚀膜孔中形成微管,有人认为这种结构能把酶氧化还原活性中心与电极连接起来,由此制成的生物传感器具有选择性好、灵敏度高的特点。Koopal 等把这一方法进一步改进,采用均匀的乳胶微粒作为聚吡咯和酶固定时所依附的多孔基体材料,由此制成的葡萄糖生物传感器对葡萄糖测定的线性响应范围为1～60mmolPL 。

一个具体的例子是：将一定量GOD的加入温度为35℃, 最终浓度为5%明胶, pH 6.8, 0.02MPB溶液(磷酸盐缓冲液)中, 搅拌均匀。取50μL上述混合液加到Teflon膜上, 均匀地涂φ10mm的酶膜, 在室温下干操。干后用2%戊二醛, pH 6.8，0.02MPB的溶液作用5min。然后用PB溶液洗去多余的戊二醛。将制成的酶膜置于4℃冰箱中保存。

取制成的酶膜用橡皮圈固定到氧电极上, Teflon膜紧贴氧电极上即可。

6、葡萄糖生物传感器性能测试指标包括：稳定性(d) 、应答时间(min) 、测定范围(mg·L-1)、测定精度、工作寿命（t）等。

7、设计实验方案：

（一）传感器制备

（1）基础电极制备

传感器采用三电极系统,包括薄膜金工作电极和对电极,Ag|AgCl参比电极。电极的制备方法：首先通过溅射工艺在柔性塑料基片上溅射镍铬|金(10 nm | 100nm)电极层,去除掩膜后,得到金工作电极(面积为0.85 cm2) 、对电极和金参比电极。然后采用丝网印刷技术在金参比电极

上丝印银和氯化银的混合浆料, 120 ℃烘箱中干燥后即得到Ag|AgCl参比电极。利用此种方法制备传感器基础电极比较简单,且可以小批量制备,由于采用的电极基底为柔性塑料,成本低,因此非常有利于实用化。

（2）氧化还原聚合物的修饰

取氧化还原聚合物8μL (中心配体为锇离子,通过亲水性的交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚耦合辣根过氧化酶(Horseradish peroxidase, HRP) ) ,滴涂在制备好的金工作电极表面,室温中过夜交联后,用去离子水冲洗,室温晾干后备用。

（3）酶的固定化

戊二醛交联法。取配制好的GOD 溶液30μL 滴加到传感器电极表面,室温放置3 h使之发生交联,然后用去离子水冲洗后,放置4 ℃冰箱保存备用。溶液中GOD浓度为1 U /μL,戊二醛为0.5 % (质量分数) ,BSA浓度为1% (质量分数)。

（二）传感器性能测试

（1）所有电化学分析实验均在10 mL电解池(内有磁子)中进行,测试底液为0.01M PBS(pH = 7.4) ,工作电位为0.0 V ( vs.Ag|AgCl参比电极) 。在测试葡萄糖动态实时电流响应时,磁子一直在电解池中匀速搅拌。在测试葡萄糖干法电流响应时,首先在静止状态下检测传感器的背景稳态电流,然后加入100mol的葡萄糖母液,搅拌60 s,以使被测物葡萄糖均匀充满整个溶液,然后停止搅拌,记录静置溶液中的稳态电流。实验温度为25 ℃。