微生物的生长量的测定方法

2. 间接计数法
➢液体稀释法
将待测样品作一系列稀释，一直稀释到取少量该稀释液 (如1mL)接种到新鲜培养基中没有出现生长繁殖为止。
具体做法是取单细胞菌悬液在定量培养基中做系列稀释培 养，在一定稀释度以前的培养基中接上菌，出现生长，而 在这个稀释度以后的培养液中没有接上菌，不出现 菌的生 长，这最后一级出现菌生长的稀释度称为临界级数，从 3～5次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较 可靠的结果。
特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出率，或 在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。
计数室
盖玻片
血球计数板是一块特别的厚玻璃片，玻片上有四 条沟和两条嵴。中央有一短横沟和两个平台，两 嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台 上刻有不同规格的格网，中央1mm2面积上刻有 400个小方格(图A)。
1
11.0
2
14.0
0
13.0
1
17.0
2
22.0
3
28.0
0
24.0
1
35.0
2
54.0
3
92.0
2. 间接计数法
➢薄膜过滤计数法
常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生 物数目。
将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋 酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取 下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样 品中所含菌数。
原液所含菌体数（mL） =每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数
计数区的结构
2. 间接计数法
➢平板菌落计数法
将待测样品进行适 当稀释，取一定的 菌悬液涂布平板， 让微生物的单细胞 一一分散在平板上
，经适宜条件培养
，每个活细胞就会 形成单菌落，然
后将形成的菌落数 乘以稀释倍数，就 可推算出样品的含 菌数。
在血球计数板上，刻有一些符号和数字(图A)，其 含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示 此计数板分25大格；
0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；
1/400mm2表示将计数室面积1mm2分400个小格， 每小格面积是1/400 mm2。
C 两种不同刻度的计数板
血球计数板有两种规格，一种是将1mm2面积分为25个 大格，每大格再分为16个小格(25×16)；另一种是16个 大格，每个大格再分为25个小格(16×25)。两者都是总 共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个 平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室 上形成0.1mm3的体积。通过对一定大格内微生物数量 的统计，可计算出1mL菌液所含的菌体数（图B)。
5
1
0
0 . 45
5
1
1
0 . 68
5
2
0
0 . 68
5
2
0
0 . 93
5
2
0
0 . 78
5
3
1
1.1
5
3
0
1.1
5
3
0
1.4
5
4
0
1.3
5
4
1
1.7
5
4
0
1.7
5
4
1
2.1
5
5
0
2.2
5
5
1
2.6
5
5
0
2.7
5
5
近似值 1 0 ~-2
0
2.3
1
3.1
0
3.3
1
4.6
0
4.9
1
7.0
2
9.5
0
7.9
1 0 ~0 0 1 1 0 0 0 0 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4
数量指标 1 0 ~-1 1 0 1 0 0 1 2 0 0 1 2 0 0 1 1 2 2 3
5次重复测数统计表
近似值 1 0 ~-2
1 0 ~0
数量指标 1 0 ~-1
0
0 . 18
5
0
0
0 . 20
5
0
0
0 . 40
例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下：
稀释度 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
重复数
5
5
5
5
5
5
出现生
长的管
5
5

5
4
1
0
数
• 根据上述结果，其数量指标为“541”，查5次重复测数统计 表，得近似值为17。乘以第一位数的稀释倍数（105 ），
• 则原液中的活菌数=17×100000=1.7×106
2. 间接计数法
➢比浊法
在科研及生产中，及时了解微生物的生长情况，测定培养 物中微生物的数量，便于适时控制培养条件，获得最佳培 养物，比浊法是最常用的测定方法。
是在浊度计或比色计上进行测定培养液中微生物的数量。 某一波长的光线，通过浑浊的液体后，其光强度将被减弱。 入射光一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比， 即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助 于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可 反应出菌液的浓度。
群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长， 这一点与研究大型生物时有所不同。
微生物的生长量的测定方法很多，可以根据菌体细胞数量， 菌体体积或质量作直接测定，也可以用某种细胞物 质的 含量或某个代谢活性的强度作间接测定。
二、微生物纯培养生长的测定方法
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需 选用不同的测定指标。
（一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板） 间接法（平板菌落计数法、液体稀释法、滤膜过滤 法、比浊法）
（二）微生物生长量和生理指标测定法 细胞干重法；总氮量测定法；其它生理指标测定法
（一）微生物细胞数目的检测法
1、血球计数板直接计数法
原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从 中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目， 换算成单位体积中的细胞数。 适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。 不适用于细菌等个体较小的细胞，因为 （1）细菌细胞太小，不易沉降； （2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。
➢平板菌落计数法
特点： 简单，灵敏，适用于细菌、酵母菌、芽孢与真菌
孢子等数量的测定。 不适合测定样品中丝状体微生物，如放线菌、丝
状真菌及丝状蓝细菌的营养体。 样品中的稀释度控制在每个平板上菌落数在30～
300个最好，过多难以计数，过少增大计数误差。
➢平板菌落计数法
★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15～20 min完成操作），严格无菌操作； ★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品 混匀处理，倾注平板时的培养基温度；
主讲：李少凤
一个微生物细胞 合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。
如果同化作用的速度超过了异化作用
个体的生长 原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加
如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。
群体内各个个体的进一步生长
群体的生长
个体生长 → 个体繁殖 → 群体生长