荧光分光光度法-精品课程

不明显。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
I F ( I 0 I t )
I t I 0 10
a b c
I0
) I 0 (1 e
2.3 abc
It F
)
I F I 0 (1 10
abc
(2.3abc ) (2.3abc ) 2 (2.3abc ) 3 )] IF I 0 [1 (1 1! 2! 3!
356nm 404nm 0.36
3. 刚性平面结构 分子刚性和共平面性越大，分子振动少，与
其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效
率提高，荧光长移。
0.2
f
1.0
f
4.取代基 给电子基团使荧光增强；荧光波长长移。 吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。
同电子体系相互作用小的取代基对荧光影响
子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低
的现象称为荧光熄灭。 荧光熄灭剂：能引起荧光熄灭的物质。 导致荧光熄灭的原因： 碰撞猝灭 M+hv→M*,M*+Q → M+热 静态猝灭 M+Q → MQ 非荧光物质 转入三重态的猝灭 三重态 荧光物质的自猝灭 荧光物质浓度较高 氧的熄灭作用
荧光熄灭法: 荧光物质加入某种熄灭剂后，其荧
消除方法：选择适当的激发波长
448 320
a.强度
360
激发 320nm 硫酸奎宁
448 350
激发 350nm 硫酸奎宁
b.强度
320
激发 320nm 0.1mol/L硫酸 360
350
激发 350nm 0.1mol/L硫酸
400
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（a）与拉曼光谱（b）
在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长(nm)
l2
l 2
l3
非辐射能量传递过程
外转换 （external conversion)：激发分子与溶剂 或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非 辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝 灭”。 系间窜越(intersystem crossing)：处于激发态分子 的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变 化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重 态。
S1
c0 c1 c2 c3 c4
∆E4 ∆E3 ∆E2 ∆E1
蒽的能级跃迁
S0
三、荧光强度与分子结构的关系
（一）物质产生荧光必须具备的条件： （1）物质的分子必须具有能够吸收紫外和较短 波长可见光的结构； （2）物质必须具有较高的荧光效率。
荧光效率（fluorescence efficiency):指激发态分 子发射荧光的量子数与基态分子吸收激发光 的量子数之比，常用 Φ 表示。
NH3+
OHH+
NH2
OHH+
NH-
利用金属离子与有机试剂生成配合物进行测定金 属离子时，配合物的稳定性和组成受溶液pH值影
响较大，从而影响到它们的荧光性质。 Ga3++邻－二羟基偶氮苯
Ga3++邻－二羟基偶氮苯
pH 3~4 pH 6~7
1:1配合物(产生荧光)
1:2配合物(不产生荧光)
4)散射光 瑞利散射光(Rayleigh scattering light)：光子与物 质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，运动方 向改变；λ瑞利光＝λ入射光 拉曼散射光(Raman scattering light) ：光子与物 质分子发生非弹性碰撞，发生能量交换，运动方 向改变；λ拉曼光≠λ入射光
第五章 分子荧光分析法 （molecular fluorescence)
分子荧光分析法
教学目标： 1.掌握分子荧光分析法的基本原理和特点； 2.掌握荧光与分子结构的关系以及荧光强度的影响 因素； 3.熟悉荧光定量分析方法及荧光分光光度计； 4.了解分子荧光分析法的应用。
分子荧光分析法
光致发光：物质分子吸收电磁辐射能后，将从基态 跃迁到较高能级的激发态，处于激发态的分子发射 出辐射的现象；最常见的光致发光是荧光和磷光。 荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第一激 发单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光。 荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的方法。
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通 过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。
传递途径 辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越
内转换
外转换
振动弛豫
2.荧光的产生
内转换 S2
S1 能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 外转换 T2 发 射 磷 振动弛豫 光
内转换 振动弛豫 系间窜越
S0
l1
荧光光谱的特征 1.斯托克斯位移(Stokes shift):
激发光谱与发射光谱之间的波长差值；荧光发 射波长总是大于激发光谱波长。
室温下菲的乙醇溶液荧光光谱
2.荧光发射光谱与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长 的能量，产生不同吸收带，但均回到第一电子激 发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而 荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的 形状与激发波长无关。
需的时间。
二、定量分析
优点 1.灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.001g/mL 2.选择性强 既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征； 3.试样量少和方法简单
缺点 应用范围小
1.标准曲线法 步骤： 1.配制不同浓度的标准 溶液 2.做IF～C关系曲线 3.求得浓度 IF IFX
激发单色器 光源 样品池
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
动画演示
1. 光源
荧光计：汞灯、卤钨灯 荧光分光光度计：氙灯 可调谐染料激光器:功率大，单色性好，热能低 实践中不使用很强的光源的原因：
1）温度升高，降低荧光强度；
2）容易使样品分解； 3）产生大量的臭氧。
2.分光系统
光强度的减少与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，
可用于测定熄灭剂的含量，这种方法称为荧光熄
灭法。
第二节 荧光分析仪器
用于测量荧光强度的仪器有：
1.滤光片荧光光度计
2.滤光片－单色器荧光光度计
3.荧光分光光度计
一、仪器的主要部件
荧光分光光度计的主要部件：激发光源、激发单 色器、发射单色器、样品池、检测器及显示系统
3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系
激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。
100 80 60 F
a
b1 c0 b0 c1 c2 c3 c4
200 280 360
∆E4 ∆E3 ∆E2 ∆E1
b2
b4 b3
蒽的激发光谱（虚线）
40
20 0
荧光光谱（实线）
440
520
nm

V=4 V=3 V=2 V=1 V=0 b4 b3 b2 b1 b0 V=4 V=3 V=2 V=1 V=0
优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法简单。
缺点：应用范围小。
第一节 基本原理
一、分子荧光的产生 1.分子的激发态 总自旋量子数：
S si
分子的多重性：
E
M 2s 1
基态
单重态S
三重态T
单重态：s=0，M=1，分子所处的电子能态。 三重态：s=1，M=3，分子所处的电子能态。
去激发过程(deactivation processes)：分子吸 收一定的能量后，电子跃迁到激发态，处于激发 态的分子不稳定，其电子可以通过辐射跃迁（发 射出光子能量）或无辐射跃迁（以热能形式将部 分能量释放出来）等释放出多余的能量而回到基 态的过程。
5.显示系统
二、荧光分析仪器的类型
1.荧光光度计 滤光片荧光光度计：不能测定光谱，用于定量分析。
滤光片－单色器荧光光度计：可以测定荧光光谱。
优点：结构简单、价廉、灵敏度高。 2.荧光分光光度计 测定激发光谱和荧光光谱; 可以同时测定两种或两种以上共存的荧光物质。
SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创）



CX 注意：固定仪器和测定条件
C
标准曲线
2.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ接比较法 步骤： 1.配制标准溶液和试样溶液 2.测IF 3.求浓度
I F ( S ) I F ( 0) I F ( X ) I F ( 0) CS CX
注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内
3.联立方程式法 两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定 分别在各自的l荧波长处测定,求出它们的含量。 两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区 别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分 不产生荧光;选用不同的激发光进行测定。
滤光片荧光计：滤光片（激发滤光片、发射滤光片） 滤光片的种类：
1.截止滤光片：用作发射单色器
2.带通滤光片：用作激发单色器 3.干涉滤光片：用作激发单色器 滤光片－单色器荧光计：发射滤光片用光栅代替 荧光分光光度计：光栅
3.样品池 用石英材料制成 4.检测器 光电倍增管、光电二极管阵列式检测器
溶剂 水 乙 醇 环己烷 CCl4 CHCl3
248 271 267 267 — —
激发光(nm) 313 365 405 350 416 469 344 409 459 344 408 458 320 375 418 346 410 461
436 511 500 499 450 502
5) 荧光熄灭 荧光熄灭（荧光猝灭）：荧光物质分子与溶剂分
Φ
发射荧光的量子数 吸收激发光的量子数
荧光效率与物质的分子结构和所处的化学环境 条件有关。
（二）荧光与分子结构
1.跃迁类型 π →π*跃迁或n→π*跃迁 2.共轭π键结构（芳香环或杂环） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移
lem

f
lex 205nm
278nm 0.11
286nm 321nm 0.29
RF-5400荧光光度计
Hitachi(日立)F-2500荧光分光光度
荧光分光光度计(澳大利亚)
第三节 定性和定量分析
一、定性分析 1.对比法 2.荧光效率、荧光寿命、荧光偏振等参数 荧光寿命(fluorescence lift time)：当除去激发光源
后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所
五、影响荧光强度的外部因素
1）温度
温度降低，荧光效率和荧光强度升高。
2）溶剂 随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*
跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也
发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低；溶
剂应达到足够的纯度。
3）pH值 具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pH值时，其 结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质 发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同发 射光波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧 光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光物质的最大激发波长（lex）和最大发射 波长（lem）是鉴定物质的根据；也是定量测定最 为灵敏的条件。
波长的巨大差异，克服了普通紫外-可见分光分析
法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光
不同，检测器与激发光不在同一直线上，激发光
不能直接到达检测器，从而大幅度地提高了光学
分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，
激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵 敏度的关键。解决杂散光影响的最好方法当然是测 量时没有激发光的存在，但是普通的荧光标志物荧 光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有
如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰 利用荧光强度的加和性（F=F1+F2+F3+ ），在 适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解。
第四节 荧光新技术和应用示例
一、荧光新技术 1.时间分辨荧光分析
利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之 间延缓的时间不同，实现分别检测的目的。
普通的荧光分析利用了荧光的波长与其激发
(2.3abc) (2.3abc) I 0 [2.3abc ] 2! 3!
2 3
当 abc 0 .05时, I F 2.3I 0 abc Kc
I F Kc
(荧光定量分析法的依据)
结论：荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限 于极稀的溶液(A<0.05)。对于较浓溶液，会产生 自熄灭现象。
二、 激发光谱与荧光光谱
激发光谱（excitation spectrum）：将激发光的光 源用激发单色器分光，使不同波长的入射光激发 荧光体，然后让所产生的荧光通过固定波长的发
射单色器而照到检测器上，测定不同波长光照射
下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光 强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。 注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光 谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则 是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。