几种不同样本的DNA提取方法

2.2 QIAGEN 石蜡样品 DNA 提取试剂盒操作步骤
1.用解剖刀修剪去除样品的石蜡 2.样品切成5-10 µm（样品表面不要接触空气） 3.立即将组织块放入1.5ml 离心管中，加入1ml 二甲苯，盖紧并混匀10s 4.室温下最大离心速度离2 min 5.小心的吸去上清，切勿吸去颗粒（沉淀） 6.加入1 ml 无水乙醇到沉淀中，震荡混匀（去除二甲苯） 7.室温（15-25℃）最大离心速度离2 min 8.吸去上清，切勿吸去沉淀 9.打开离心管盖子，室温或37℃晾干，约10 min，直到乙醇完全蒸干 10.沉淀中加180 µl Buffer ATL，再加入20 µl 蛋白酶 K，震荡混匀 11.56℃消化1h，直到样品完全裂解 12.90℃孵化1h（在 Buffer ATL 中90℃孵化可逆转部分甲醛修饰的核酸）（如 果只有一个加热器，放在室温等温度升到90℃是再放上去） 13.快速离心收集管壁上的液体（等温度降到室温，如必需可加入2µl R N A（100 mg/ m l）酶室温孵育2 min 去除 RNA） 14.加入200 ml Buffer AL 混匀再加入200 µl 无水乙醇充分混匀，可能会产生白 色絮状沉淀（如果样品比较多可以将 Buffer AL 和乙醇预先加在一起再加入 以节省时间） 15.快速离心收集管壁上的液体 16.将上清小心转移到 QIA 2 ml 离心柱中，6000×g（8000rpm）离1 min，倒掉 废液，（如上清未完全离下，可加大转速再离直到完全离下） 17.小心打开盖子，加入500 µl Buffer AW1，6000×g（8000rpm）离1 min 18.倒掉废液，小心打开盖子加入500 µl Buffer AW2, 6000×g（8000rpm）离 1 min 19.倒掉废液，将柱子放入干净的2 ml 管中，空管离心20000×g（14000rpm） 离3 min 20.将柱子转移到1.5 ml 干净的离心管中，小心打开柱盖加入20-100 µl Buffer ATE 于膜中央 21.室温（15-25℃）孵育1-5 min，再20000×g（14000rpm）离1 min 收集产物
提 RNA 用
室温 室温 ≤-20℃ ≤-80℃
碎后≤-20℃储存 b.低温运输 a.室温运输 b.如能在病理样品制备时所有福尔马林 能加入 RNA 酶抑制剂更佳。
a.室温运输 b.如能在病理样品制备时所有福尔马林 能加入 RNA 酶抑制剂更佳。
a.不得使用肝素抗凝 b.加入2倍 Trizol 后≤-20℃储存 a.直接≤-80℃储存，或加入2ml Trizol，剪 碎后≤-20℃储存 b.低温运输
2.5 QIAGEN 血浆/血清/胸腔积液提取 DNA 试剂盒操作步骤 1．加20µL Protease K 到1.5ml 离心管中。 2．加200µL 的样品液。
3．加200µL 的 Buffer AL，涡旋15s。 4．56℃温育10min，直到裂解完全。 5．快速离心。 6．加200µL 乙醇（100%）， 涡 旋 15s，快速离心。 7．转移混合液到 Spin column（2ml 收 集 管 ），6000g 或8000rpm，离1min，换新 管，弃掉旧的收集管。 8．加500µL Buffer AW1，涡旋15s，6000g 或8000rpm，离1min，弃旧管换新管 。 9．加500µL Buffer AW2，涡旋15s，全速（20，000g 或14，000rpm）离1min。 10．换新管，全速（20，000g 或14，000rpm）空管离心3min。 11．新离心管，100µL Buffer AE 温室温育5min，6000g 或8000rpm，离1min， 重复洗脱3次。 注：血浆/血清/胸腔积液的游离 DNA 较少建议每个样品不少于800µL，即每个 样品分成4管以上，进行1到6步骤处理，当到第七步时，4管转移到同一个 Spin column（2ml 收 集 管 ）。
体积不少于5ml 不少于0.2克 不少于1克
检测用途 提 DNA
用 提 DNA
用
提 DNA 用
提 DNA 用
提 DNA 用
提 DNA 用
提 DNA 用
提 DNA 用
提 RNA
存放条件 ≤-20℃ 室温 室温 2~8℃
≤-20℃
≤-20℃
≤-20℃ ≤ -20℃ 来自百度文库-80℃
备注
a.低温运输。
a.如是整块蜡块，余下2/3封蜡后检测完 毕后寄回。 a.可以是已经切好并已放在载玻片上的
a.低温运输
a.直接≤-80℃储存，或加入2ml Trizol，剪
病变组织
用
肿瘤组织 病例蜡块
不少于1/3块
提 RNA 用
肿瘤组织 病例石蜡切
片
全血
a. 5微米切片不少于6 片 b.10微米切片不少于4 片(表面积>0.8mm2)
体积不少于3ml
提 RNA 用
提 RNA 用
新鲜活检样 品
不少于0.2克
2样品 DNA/RNA 提取
2.1 QIAGEN 血液提取 DNA 试剂盒操作步骤
1．加20µL Protease K 到1.5ml 离心管中。 2．加200µL 的样品液（50~100µL 抗凝血，补充 PBS 到220µL）。 3．加200µL 的 Buffer AL，涡旋15s。 4．56℃温育10min，直到裂解完全。 5．快速离心。 6．加200µL 乙醇（100%）， 涡 旋 15s，快速离心。 7．转移混合液到 Spin column（2ml 收 集 管 ）， 6000g 或8000rpm，离1min，换新 管，弃掉旧的收集管。 8．加500µL Buffer AW1，涡旋15s，6000g 或8000rpm，离1min，弃旧管换新管。 9．加500µL Buffer AW2，涡旋15s，全速（20，000g 或14，000rpm）离1min 10．换新管，全速（20，000g 或14，000rpm）空管离心3min。 11．新离心管，100µL Buffer AE 温室温育5min，6000g 或8000rpm，离1min，重 复洗脱3次。
2.3 QIAGEN 组织提取 DNA 试剂盒操作步骤
1．取10mg-25mg 组织剪碎（剪至约芝麻大小），碎片放入1.5ml 离心管。 2．加入180µl Buffer ATL,再加入20ul 蛋白酶 K，混匀。 3．56℃消化，消化至完全（一般为1-3小时，也可消化过夜，消化时需振动）。 4．涡旋15s，加入200µl Buffer AL，混匀，在加入200µl 乙醇（96%~100%）， 混匀。（量大时也可先把 Buffer AL 和乙醇混合，在一起加） 5．转移混合液到 Spin column（2ml 收 集 管 ），6000g 或8000rpm，离1min，换 新管，弃掉旧的收集管。 6．加500µlBuffer AW1，涡旋15s，6000g 或8000rpm，离1min，弃旧管换新管 。 7．加500µlBuffer AW2，涡旋15s，全速（20，000g 或14，000rpm）离1min。 8．换新管，全速（20，000g 或14，000rpm）空管离心3min。 9．新离心管，100µlBuffer AE 温室温育5min，6000g 或8000rpm，离1min， 重复洗脱3次。 捣碎组织方法： 把剪切好的块状组织放入一次性 PE 手套中，然后用小锤子轻轻锤打，直至组 织完全被捣碎。再把捣碎好的组织刮入1.5ml 离心管中，并用生理盐水清洗手套， 使残余的组织完全洗入离心管中，高速离心，弃上清，沉淀中加入 Buffer ATL
切片。 b.用切片机切片后，可直接用干净的镊子
将组织切片转移至干净的离心管、 或其它可密封的容器中。 c.如果肿瘤组织切片的面积较小，请适当 增加切片的数量。所有切片均为未 经染色的白片。 a.不得使用肝素抗凝 b.采集后时间不超过1周 c.低温运输 a.不得使用肝素抗凝 b.全血采集完4小时内进行血浆分离 c. 血浆分离操作： 1.将全血用800转/分钟，离心10分钟 2.取上清，将上清移到另一个新的离心管 中 3.将此上清液8000转/分钟，离心10分钟 4.取上清，并将上清移到另一个新的离心 管中，此上清即血浆。 d.低温运输或直接使用商业化试剂盒提 取 DNA。 a.全血采集完2小 时 后 ，5小时内进行血清 分离 b.血清分离操作： 1.将全血用800转/分钟，离心10分钟 2.取上清，将上清移到另一个新的离心管 中 3.将此上清液8000转/分钟，离心10分钟 4.取上清，并将上清移到另一个新的离心 管中，此上清即血清。 c.低温运输 a.采集时间不超过1周 b.低温运输
22.可重复上步 注意事项： 1．所有的离心步骤都在室温（15-25℃）下进行 2．所有的 Buffer 使用前放置到室温（15-25℃） 3．确保 Buffer AW1和 Buffer AW2中以加入了乙醇，19 ml Buffer AW1中加入25ml 的乙醇，13 ml Buffer AW2中加入30 ml 的乙醇 4．一次最好只打开一个盖子，注意避免产生气溶胶 5．如果 Buffer ATL 和 Buffer AL 中有沉淀物，使用前70℃加热搅拌 6．残留的甲醛水（福尔马林）能抑制蛋白酶 K 的消化 7．该试剂盒在2-8℃下可保存一年以上，室温（15-25℃）只能保存四周 8．蛋白酶 K 应放置2-8℃保存
和蛋白酶 K。 2.4支气管灌洗液的处理
1．将支气管灌洗液用1000转/分钟，离心10分钟。 2．收集沉淀细胞，去上清。 3．收集到的细胞，用200µL PBS 溶重悬沉淀细胞。 4．加20µL Protease K 到1.5ml 离心管中。 5．加200µL 的 Buffer AL，涡旋15s。 6．56℃温育10min，直到裂解完全。 7．快速离心。 8．加200µL 乙醇（100%）， 涡 旋 15s，快速离心。 9．转移混合液到 Spin column（2ml 收 集 管 ）， 6000g 或8000rpm，离1min，换新 管，弃掉旧的收集管。 10．加500µL Buffer AW1，涡旋15s，6000g 或8000rpm，离1min，弃旧管换新管 。 11．加500µL Buffer AW2，涡旋15s，全速（20，000g 或14，000rpm）离1min。 12．换新管，全速（20，000g 或14，000rpm）空管离心3min。 13．新离心管，100µL Buffer AE 温室温育5min，6000g 或8000rpm，离1min，重 复洗脱3次。
样品类型 新鲜肿瘤 病变组织 肿瘤组织 病例蜡块 肿瘤组织 病例石蜡切
片
全血
血浆
血清
胸腔积液 新鲜活检样
品 新鲜肿瘤
样品类型、采集要求与处理
数量要求 不少于1克 不少于1/3块 a. 5微米切片不少于6 片 b.10微米切片不少于4 片(表面积>0.8mm2) 体积不少于3ml
体积不少于1ml
体积不少于1ml