血站核酸扩增检测实验室工作规范1

血站核酸扩增检测实验室工作规范

为使核酸扩增检测技术有效地应用于血液筛查，保证血液安全，特制定本规范。

一、血站核酸扩增检测实验室的规范化设置及其管理

血站核酸扩增检测实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫医发[2010](待定)号文）附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置血站核酸扩增检测实验室。

血站核酸扩增检测实验室应根据仪器设备特点设置工作区域，各区域仪器设备应固定不可移至其它区域。各区域都必须有明确的标记，以避免设备实验器材如加样器、试管或加样器吸头架、试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备和实验器材发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本处理（混样）、核酸纯化、扩增检测区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。

清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增检测区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

（一）试剂贮存和准备区

下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。

主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性可通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于“热启动”技术（在第一个高温变性步骤后加入酶），聚合酶也可不包含在主反应混合液中。

在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并根据需要及时更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。

严禁用嘴吸取液体，离心管和吸头等消耗品应适用于核酸检测，无DNase、RNase等扩增检测抑制物，或采取高压等处理措施处理。

工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基对（bp），对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。

（二）标本处理区

下述操作在该区进行：标本用于混合或核酸纯化前的保存，标本的混合，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。

要正确使用标本处理设备，包括样本混合、核酸纯化设备。由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件，避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序。

用过的加样器吸头必须放入专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液）容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等）如出现外溅，则必须分别处理并做出记录。

对实验台适当的紫外照射（254nm波长，与工作台面近距离）适合于灭活去污染。可采用可移动紫外线灯照射工作后的实验台面

样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。

（三）扩增（检测）区

下述工作在本区内进行：cDNA合成、DNA扩增及检测。不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。

为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。必须注意的是，所有经过检测的反应管不得在此区域打开。

完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理并做出记录。

（四）扩增产物分析区

下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。但目前用于血液核酸检测的试剂该区域通常与扩增区合并使用。核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标记）、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法等。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1 mol/L HCl中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。

由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故应注意实验人员的安全防护。

本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下（如安装排风扇）可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。

二、血站核酸扩增检测实验室质量保证

血站核酸扩增检测实验室质量保证涉及到整个扩增检验的所有阶段，即测定分析前的标本采集及其运送和保存、测定中的核酸提取、扩增检测以及测定后的结果报告等。

（一）标本的采集。

用于血液核酸扩增检测的标本包括血清和血浆（EDTA或枸橼酸钠抗凝）等。采集血液等样本时，应使用一次性无菌含分离胶真空采血管。采样时必须戴一次性手套。

玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。

如使用血浆标本，全血标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。

临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。

（二）标本的运送

标本采集后必须尽快送至实验室。通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。

（三）标本的贮存。