取小鼠脑组织

丁香园上面总结的方法，排版有点乱。

其实过程与大鼠近似，我的经验是：

1.材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；

2.步骤：处死小鼠，取头颅；

剪开皮肤，漏出颅骨；

用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；

再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；

当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；

然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。

3.注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；

用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；

去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；

取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；

若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。

做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠

剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳

先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了

再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬

小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。

具体操作如下：

实验操作步骤：

1)小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。

2)将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。

3)解剖小鼠，暴露心脏。

4)找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约 0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。

5)将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。

6)将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，注意不要产生气泡，开始灌流。此时如果看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，说明达到固定效果。

7)灌流大约5分钟，灌流液用量约150毫升左右结束。（小鼠的用量没这么多）

8）取材。取实验所需的标本。

9）将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛（戊二醛）中固定2——4小时后移至30%蔗糖中4度冰箱保存过夜。

我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰冻切片机，我们的leica1900的，不知道lz那里有没有这个机子，还有一种原始的自己刷冻台的那种，比较麻烦，切片厚度大概选择20-40um差不多

开胸时要把肋骨提起，大U字剪开左右肋弓后掀起，血管钳固定一下（以免挡遮视野）；平头针插入后稍许打开输液器开关并迅速剪开充盈的右心耳（可见血涌出），用血管钳将心室和平头针一起钳夹固定再推（但滴速也不能太快以免血管被冲破，使灌流液流进肺里）。另：开胸时动作尽量要快；针头可以不插入主动脉，留置于左室也行。

试剂名称：4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠

所需药品及剂量：A液：多聚甲醛40g

蒸馏水400ml

B液：Na2HPO4·2H2O 6.88g

蒸馏水300ml

C液：NaOH 3.86g

蒸馏水200m

操作过程：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制，至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C 液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合

应用范围：光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛

保存期限及温度：4℃冰箱保存备用，长期保存

我在很多方面是个新手，经常在园子里逛，学到了很多东西，但同时也看到了关于同一个问题有很多不同的回答，我想结合自己的实验，希望各位老师能就我提出的问题说说自己的经验看法，给我启示，因为很多自己未做过，怕自己哪里操作不恰当而影响实验结果，非常感谢各位老师的不啻赐教！

首先，我做的是大鼠（体重约230-250g），模型是大脑中动脉栓塞，在不同的时间点取脑标本，准备做荧光实时定量PCR、Western blot和冰冻切片，我提的问题主要是在于脑标本的取和存方面。

问题如下：

荧光实时定量PCR方面：

1、标本需要灌注么，有战友说不需要，你是怎么做的，有灌注的话什么溶液灌注，温度？

2、标本取下后液氮速冻，然后转-80度冰箱，这样保存一般可以多久？

3、抽提后的中RNA放-80度冰箱会很容易降解么，还是说要放液氮？

Western blot方面：

4、标本用什么溶液灌注，温度？

5、同一个标本可以同时用于RT-PCR和Western blot检测么？（如果灌注手段一样的话）

冰冻切片方面：

6、灌注冲血用什么溶液，温度？

7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？

8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？

9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每种浓度里沉底后就换另一种还是？

10、我试做过一次，做法为：常规多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定过夜，然后30%的蔗糖脱水，这些都是用0.1M的PBS配的，结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底（中间换过一次蔗糖溶液）。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好，如果你有跟我做一样的模型标本，你是怎么处理的，如何切？

11、还有什么需要注意的地方或tips。

灌注冲血用什么溶液，温度？

用的是含有肝素钠的生理盐水。每瓶500ml的生理盐水加入80mg的肝素钠，肝素钠要避光保存，而且必须使用前临时加入到生理盐水中。肝素钠生理盐水需要用4度预冷。我们用注射器推，大概推100ml，10min。就可以将血液冲干净。速度要自己掌握。

每支肝素钠每亳升含12500U，相当于100mg，用20ml生理盐水稀释，分装成40支，消毒备用（4℃贮存）。临用时，注射器吸取肝素钠溶液一支，而后将肝素液来回抽动，使针筒局部湿润，多余肝素液全部排出弃之，注射器内死腔残留的肝素液即可抗凝。

纯的肝素10 mg能抗凝100 ml血液（按1mg等于100个国际单位，10个国际单位能抗凝1ml 血液计）。如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。用于试管内抗凝时，一般可配成1%肝素生理盐水溶液，取0.1ml加入试管内，加热80℃烘干，每管能使5～10 ml 血液不凝固。作全身抗凝时，一般剂量为：大鼠 2.5～3 mg·(200～300g体重)-1,兔或猫10 mg·kg-1,狗5～10 mg·kg-1。如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。

7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？

一般多聚甲醛灌注20min，100ml。标准是动物的尾巴会甩动，全身四肢收缩（这是因为蛋白变性所致），一般看起来像动物活过来了一样。随后就可以将动物的头断掉，来取脑了。

8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？

这个不一定。对于石蜡切片，可以固定很久。但是对于冰冻切片，估计是隔夜或者24h。但是先固定一晚上后再取出来，将不需要的大脑组织切掉，比如脑干、小脑等等。擦干，放在蔗糖溶液里。

9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每种浓度里沉底后就换另一种还是？

蔗糖用0.1M的PB配置。我一般配20%和30%两个浓度。我个人感觉每个浓度需要沉糖48h。至少我发现24h是不够的。沉糖必须完全沉底。

10、我试做过一次，做法为：常规多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定过夜，然后30%的蔗糖脱水，这些都是用0.1M的PBS配的，结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底（中间换过一次蔗糖溶液）。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好，如果你有跟我做一样的模型