第21章 常用分子生物学技术的原理及应用

Northern 印 迹 杂 交 的 基 本 过 程
与Southern blotting比较
相同点：原理均为毛细管作用
不同点
•转移的是RNA •转移前无需酶切 •转移效率较高 •变性方法
Northern blotting 用途 • 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平。 • 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
PCR体系基本组成成分

模板DNA
特异性引物(长度20nt左右)
耐热DNA聚合酶


dNTPs
Mg2+
PCR
反 应 循 环 延伸
适温
(72˚C左右)
变性
95˚C左右
退火
Tm-5˚C
(55˚C左右)
经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍 数为(1+x)n, x=75%, n为循环数.
二、PCR技术的主要特点 1.特异性强 2.灵敏度高
印迹（ blotting）
在杂交之前，通常用琼脂糖凝胶分离待
测的DNA分子，再将分离的DNA片段转移到
特定的支持物上。由于转移后各个DNA片段
在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一
样，故称为印迹（ blotting）。
（一）Southern印迹杂交
Southern印迹杂交（Southern blotting）是
常用的蛋白质是抗体，因此被称为免疫印迹
（immunoblotting）技术。
与DNA和RNA印迹相似之处
首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小
分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质
的位置可保持在胶中的原位上。
与DNA和RNA印迹不同之处

蛋白质的转移只有靠电转移 蛋白质的检测以抗体作探针 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶 （HRP）标记第二抗体，底物显色来检测 蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂 结合以提高敏感度。
Western blotting
第2节 PCR技术的原理与应用
（Polymerase Chain Reaction，PCR） 聚合酶链反应
PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的体外扩增基因片段的方法，它 具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、 易自动化等突出优点，是分子生物学技术中 一项具有革命性的创举。 PCR方法被美国Science杂志评为1989年 的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被 评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。
一、PCR技术的基本原理
Template DNA
5 5
5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
5 5 5
5
Cycle 2
5 5 5 5
5
5
5 5
Cycle 3
5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
基因的导入方式主要： 显微注射法 胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法
转基因技术
基本原理是采用基因转移技术使目 的基因整合入受精卵的细胞核内或着床 前的胚胎干细胞，然后将细胞导入受体 动物子宫，使之发育成个体。
转基因——被导入的目的基因
转基因动物(transgenic animal)
——目的基因的受体动物
二、蛋白质芯片 (protein chip)
又称蛋白质阵列 (protein array)
将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品 反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测 系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技 术。
蛋白质芯片分析的基本原理是蛋白
质与蛋白质分子之间在空间构象上能 特异性的相互识别和相互结合，如抗
3.简便快速
4.对标本的纯度要求低
三、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的扩增与克隆
1. 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的 mRNA获得目的基因片段。 2. 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模 板获得已知目的基因片段。 3. 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中 获得具有一定同源性的基因片段。 4. 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中 随机克隆基因。
基因组DNA
重物 纸巾 10×SSC 转移缓冲液 500g
DNA酶切片段
玻璃板 Whatman滤纸 NC膜或尼龙膜 凝胶 Whatman滤纸
1 2
支持物
NC或尼龙膜
与探针同源杂交的 基因DNA片段
放 射 自 显 影 照 片
Southert blotting用途
• 基因组DNA的定性与定量分析。
如对在基因组中特异基因的定位及检测等。
体与抗原或受体与配体之间的特异性
结合。
最常用的探针是抗体，因为抗体
与抗原结合的特异性最强。
第6节 蛋白质相互作用研究技术
（二）基因的体外定点突变
（三）基因突变分析 （四） DNA和RNA的微量分析
（五） DNA序列测定
Байду номын сангаас
四、几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术 (RT-PCR)
（二）原位PCR技术 (ISP)
（三）实时PCR技术 (real time PCR)
反转录PCR法：
方案：
5′
加热变性
mRNA
TTnT 5′ AAnA 3′
指DNA与DNA分子之间的杂交。其基本过程
是将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性
后，将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支
持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。
探针（probe）
是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片 段，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基 因序列的DNA或RNA片段。
探针的种类
（三）其他核酸杂交方法 1.斑点印迹杂交
2.原位杂交（in situ hybridization）
二、蛋白质印迹技术(Western blotting)
蛋白质印迹技术是根据蛋白质分子之间存在
相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将
其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）
上，再用相应的蛋白质分子对其进行检测。最
二、核转移技术
核转移技术 （nuclear transfer） 即动物整体克隆技术，将动物体细
胞核全部导入另一个体的去胞核的受
精卵内，使之发育成个体，即个体克
隆(clone)。
如克隆羊多利
三、基因剔除技术
基因剔除技术（gene knock-out） 也称基因靶向(gene targeting)灭 活，有目的去除动物体内某种基因的 技术。 基本原理：同源重组 基因剔除细胞系、基因剔除小鼠
第二十一章 常用分子生物学技术 原理及其应用
第1节 第3节 第4节 第5节
分子印迹与杂交技术 基因文库 基因修饰动物模型的建立及应用 生物芯片技术
第2节 PCR技术的基本原理与应用
第6节 蛋白质相互作用研究技术
第1节
分子印迹与杂交技术
一、核酸分子印迹与杂交技术
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 把不同来源而具有一定同源性的DNA分子 放在同一溶液中做变性处理 ，或把单链DNA 与RNA放在一起，在一定条件下，它们之间的 同源区域可按碱基互补原则复性形成杂合双链， 这一过程称为杂交。
寡核苷酸 基因组DNA cDNA片段
RNA片段
标记物
放射性同位素 生物素 荧光染料
Southern印迹杂交的基本步骤

待测DNA样品的限制性内切酶消化 酶切DNA样品的电泳分离
凝胶中DNA的变性和Southern转移
探针的制备

Southern杂交 杂交结果的检测

1 2 M 内切酶
是指一个包含了某一生物体全部 DNA序列的克隆群体
基因组DNA文库 (Genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library)
一、基因组DNA文库
基因组DNA文库（Genomic DNA library)
是指包含某一生物体全部基因组DNA序列的 克隆群体，其储存着一个细胞或生物体的全 部基因组DNA的编码区和非编码区的DNA片 段，含有基因组的全部遗传信息。
二、 cDNA文库
cDNA文库是指某一组织在一定条件下 所表达的全部mRNA经反转录而合成的全部 cDNA的克隆群体，它将细胞的基因表达信 息以cDNA的形式储存于的受体菌中。
基因组 DNA文库
cDNA文库
第4节 基因修饰动物模型 的建立及应用
一、转基因技术
是指将外源基因整合到动物细胞或植物 细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或 植物细胞中稳定遗传和表达的技术。
•重组质粒和噬菌体的分析。
（二）Northern印迹杂交
利用类似于Southern印迹杂交的技术来 检测RNA称为Northern印迹杂交（Northern blotting）。 Northern印迹杂交基本原理和过程与 Southern印迹基本相同，只是检测的分子是 RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定 性或定量分析。

或用同位素标记第二抗体，放射自显影法 检测蛋白区带的信号。
Western blotting应用
• 检测样品中的特异蛋白质的存在
• 细胞中特异蛋白质的定量分析 • 蛋白质分子的相互作用研究
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
水平槽
水平槽
垂直槽
Southern blotting Northern blotting
四、基因转移和基因剔除的应用
•建立疾病动物模型
• 已建立：地贫、动脉硬化、帕金森病等
•生物制药 •治疗性克隆和生产用于人体器官移植的动
物器官
国家“973”组织工程学首席科学家曹谊 林教授1998年曾在老鼠背上培育出人耳 朵
第5节 生物芯片技术
一、基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip)、DNA阵列(DNA array) •cDNA芯片(cDNA chip) 指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为 探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的 支持物上。 使探针与荧光标记的待测样品分子进行 杂交，通过检测系统检测杂交的荧光信号和 强度，从而获取样品分子的数量和序列信息。
加入特异性引物
反转录酶
cDNA
3′ 5′
mRNA
TTnT 5′ AAnA 3′
DNA聚合酶
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)
重复上述步骤
扩增出大量的产物
实时 PCR 技术 原理
第3节
基因文库
Gene Library
基因文库 (gene library)