拟南芥的种植

一、拟南芥播种

种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；

吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；

稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；

将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。

MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm的培养皿用12.5ml。二、MS固体培养基制备

1．培养基母液的配制和保存

MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。

大量元素(母液Ⅰ，20×) mg／L

NH4NO3 33 000

KNO3 38 000

CaCl2·2H2O 8 800

MgSO4·7H2O 7 400

KH2PO4 3 400

微量元素(母液Ⅱ，200×) mg／L

KI 166

H3BO3 1 240

MnSO4·4H2O 4 460

ZnSO4·7H2O 1 720

Na2MoO4·2H2O 50

CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5

铁盐(母液Ⅲ，200×) mg／L

FeSO4·7H2O 5 560

Na2-EDTA·2H2O 7 460

有机成分(母液Ⅳ，200×) mg／L ⅣA

肌醇20 000

ⅣB

烟酸100

盐酸吡哆醇(维生素B6) 100

盐酸硫胺素(维生素B1) 100

甘氨酸400

上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。

母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。

2．配制培养液

用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA 和ⅣB各5 mL。

3．溶化琼脂

4．调pH

用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8，因高温灭菌时pH会下降，所以灭菌前通常pH配成6.2左右)。

5.培养基的分装

6．高压灭菌

三、拟南芥的种植

1．人工土配制

18份蛭石，6份黑土和1份珍珠岩混合均匀，分装于塑料灭菌袋内，扎好口，于98 kPa、121.3 ℃下，灭菌40 min。冷却后备用。

有时也用两种土，即上层用不含黑土的人工土，下层用上面所讲的土。我估计原因可能有二：一是黑土容易生霉；二是黑土较难完全粉碎，较大的块状土不便于移栽。

2．PNS营养液：

每升含

5ml 1M KNO3，

2ml 1M Ca(NO3)2˙4H2O，

2ml 1M MgSO4˙7H2O，

2.5ml 20mM Fe.EDTA，

2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），

1ml 微量元素。

注意：营养液用煮沸冷却后的凉开水配置。

PNS营养液母液配方：

①1M KNO3 101.1g

②1M Ca(NO3)2˙4H2O 236.15 g

③1M MgSO4˙7H2O，246.48 g

④20mM Fe.EDTA：

FeSO4 5.57g

EDTA 7.45g

注意先各自配成溶液，再混合。

⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：

磷酸二氢钾 130.4g

磷酸氢二钾 9.12g

⑥微量元素

硼酸 0.434g

硫酸锰（MnSO4 H2O） 1.7626g CuSO4˙H2O 0.0798g

ZnSO4˙7H2O 0.172g

NaMoO4˙2H2O 0.0432g

NaCl 0.585g

CoCl˙6H2O 0.00129g

以上母液均配至1L

种子春化

A．取适量种子置于标记好的1.5ml离心管中，加入1 ml 70％乙醇轻微振荡1 min B．去乙醇，加入1 ml体积分数为10％的NaClO (次氯酸钠), 消毒5~10 min；C．吸去NaClO, 用无菌水冲洗种子5次后, 加入600μl无菌水；

D．用1ml移液枪将水连同种子吸起，均匀铺于MS平板，每皿60~100粒种子；

E．吸去并风干培养基表面多余的水分。

F．加盖，封口，4℃冰箱放置2~3 d，春化使种子萌发同步化。

土壤培养

从春化算起，平板上培养7~14 d，当幼苗具4片真叶时转入土壤(1株/盘)进行土培。加盖保鲜膜1 d，及时浇水。

培养条件

温度：20℃~22℃；湿度：70％左右；光照强度：100~120 µmolּm-2ּsec-1；在长日照条件下（16h光照，8h黑暗）培养。不同光质处理时，各种光质相应光强分别为，蓝光（BL）：20 μmol.m-2.s-1；红光（Rc）：20 μmol.m-2.s-1；远红外光（FRc）：1.8 μmol.m-2.s-1，其余条件同前。