r干扰素释放试验检测方法培训-2015.11.27

首都胸科医院与我院检测程序中的不同点
要素 采血管 胸科医院 我院 可能造成影响 说明书要求 成人采血量要求取 6ml肝素抗凝采血管 用枪头吹打 枪头 6mlBD肝素抗凝采 血管 混匀PBMCs时 用枪头吹打 洗板 细胞计数 枪头 血细胞分析仪 4mlBD 肝素抗 PBMCs过少 凝采血管 振荡器 PBM Cs洗涤不 干净或破碎 洗板机 PVDF膜被破坏
第一步：采血
<2 儿童 2-9岁儿童 成年人或>10儿童 免疫低下/受抑制成人
2ml静脉血 4ml静脉血 6ml静脉血 8ml静脉血
第二步：单个核细胞（PBMC）分离
按照血液：Ficoll淋巴分离液=2～3:1 轻缓加于Ficoll淋巴分离液上
层，注意不能够将血样与分离液混合。室温下（18-25℃），1000 RCF(g)
配置抗体 （多配1-2个样本量） 加入抗体，4度孵育1h
加入显色液（避光5-7分钟）
第八步：读板
固定读板人员和读板仪器
CTL AID
T-SPOT.TB 结果判读
< 10
A
wk.baidu.com
B
斑点相减
C
D
> 20
通常正常结果，空白对照孔没有或很少斑点（<10个），阳性质控对照孔斑点数 >20个。
T-SPOT.TB 结果判读
第四步：计数细胞
• 计算公式：
需要的细胞悬液量(ml)=每个培养孔需要加入细胞数量 /(100,000)×需要使用 的细胞稀释液量 (ml)/ 计数的每ml细胞数量 (106 / ml)。
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
T淋巴细胞）
T-SPOT.TB 技术原理
+ 抗原
基于ELISPOT技术，计数分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞数目
T-SPOT.TB
• 基于外周血单个核细胞（PBMC）的ELISPOT 技术， 敏感性更高。 • 每例样本同时检测4个孔：
阴性对照孔(N): 无任何抗原刺激
TB抗原孔(A): ESAT-6 (panel A)
阳性抗原PHA
抗体、显色液
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用） 1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌 双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌） 细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液 台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
尿沉渣板进行 死细胞不能区分 血细胞计数时应该 计数 用0.4%台酚蓝进行 活细胞的染色 3ml淋巴细胞 PBMCs层分离不 分离液,全血 好 进行1:11640 稀释后注入 3ml淋巴细胞分离 液,全血进行 1:11640 稀释后注入 洗板后加显色液
步骤
加入淋巴细胞分离 液的量在6ml,而且 直接将全血注到淋 巴细胞分离液液面
常见问题小结
2、斑点和PVDF膜
问题 PVDF膜背景高 潜在可能 洗板不充分 PVDF膜没有充分干燥 PBMCs洗涤不干净或破碎 可能解决方法 增加洗板次数及浸泡时间 (6次) PVDF膜彻底干燥后再进行斑点读取。 重复洗涤，吹打细胞沉淀不暴力
PBMCs细胞混有较多红细胞 采集血样后室温保存并4小时内处理， 更换淋巴细胞分离液， 必要时进行红细胞破碎处理(蒸馏水)。 显色时间过长 孔中出现空白区域 细胞分布不均匀 斑点不清晰 细胞孵育时细胞移位 实时检测显色过程，适时终止反应。 细胞培养时避免剧烈晃动或拍板； 溶液加样时避免气泡产生 细胞培养时避免培养板震动，以免斑点“拖尾”
离心22分钟。
45度角 缓慢加入淋巴细胞分离液
1000g，22min 务必缓降
中间白膜层
第三步：收集PBMC
吸取中间白膜层并转移至无菌15ml尖底离心管，生理盐水和RPMI1640培 养基各洗涤细胞1次，弃上层液，加入0.5ml AIM-V培养基重悬细胞。取适量 混匀的细胞悬液适当稀释后进行细胞计数。
加酶孵育1小时后不 洗板后加显色 显色效果较差 进行洗板直接扣掉 液 加显色液
• 北京胸科医院所用耗材
独立包装1ml无菌吸管 15ml无菌试管
• 分离效果图
QuantiFERON®-TB
γ-干扰素释放试验（IGRAs）
• 结核杆菌感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞。
• 当效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会大量分泌IFN-γ
• 直接检测IFN-γ 或者检测分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞可用于
诊断是否有结核杆菌感染。（隐性感染即存在活菌/存在效应
生理盐水洗涤1次(也可用1640)， 18℃，600g，7min RPMI1640培养基洗涤1次 18℃，350g，7min
500ulAIM-V 培养基重悬
第四步：计数细胞
血球计数板人工计数 细胞计数仪计数
每ml细胞数量= 细胞计数× 稀释倍数×104
调整PBMCs浓度：2.5*106cell/ml 需要500ul（100ul*4孔）
T-SPOT.TB 有效斑点
斑点特点：
1、圆形，实心、有核结构 2、大小不均一
特异性斑点
非特异性斑点
T-SPOT.TB 有效斑点
斑点数在阳性阈值上下的，务必人工辅助判读。
常见问题小结
1、外周血处理-PBMCs
问题 细胞量少 潜在可能 白细胞减少症 错误的血液收集 采血管放置温度不是18-25℃ 血液存储超过推荐时间 红细胞污染 采血管放置温度不是18-25℃ 错误的离心分离 淋巴细胞分离液效果欠佳 没有明显或清楚 离心速度过低 的单个核细胞层 离心时间过短 淋巴细胞分离液效果欠佳 高血脂标本 结果无效 无效结果可能由许多不正确的标本处 理情况引起 ，也可能由污染引起。 可能解决方法 增加采血量 不能使用含有EDTA的采血管 确保采血管放置温度是18-25℃ 确保血液存储在4-6小时内 确保采血管放置温度是18-25℃ 增加离心时间到30min 调整离心机降速到最缓和 更换淋巴细胞分离液 增加离心速度到1500-1800g 增加离心时间到30min 更换淋巴细胞分离液 采集空腹血液标本 上面提到的部分 保证试剂无菌 保证操作无菌
第五步：铺板
可拆卸板（按样本数取出相应条数）
25万个细胞/孔 （100ul） 细胞培养箱（37度） 16-20h（过夜） 避免交叉污染、混匀细胞悬液
第六步：洗板
200ul 1×PBS 垂直冲入
倒扣培养板，甩干液体 纸巾上拍打干净 反复洗涤6次， 个别红细胞残留孔，反复冲洗至无肉眼可见颜色。
第七步：抗体孵育、显色
所有试剂使用前提前1-2h平衡至室温（抗原可适当减少平衡时间）
T-SPOT.TB操作流程
Procedures:
6ml
Ficoll
250,000 cells/well
第一步：采血
推荐使用： 肝素/肝素钠/肝素锂抗凝管 (提问: 4ML采血管可行吗?回答:更改为6ML)
样本采集后4小时内分离外周血单个核细胞， 室温放置，请勿置于冷冻或冷藏室。
N孔斑点数 >10 P孔斑点数 任何值 ≥20 ≤5 ≤19 T孔-N孔斑点数 任何值 任一孔 ≥6 结果判定 不确定 阳性
两孔均 ≤5
任一孔 ≥6 两孔均 ≤5 任一孔 ≥N 两孔均 <N 任一孔 ≥N 两孔均 <N
阴性
阳性 不确定性 阳性 阴性 阳性 不确定性
≥20 6≤N≤10
≤19
空白对照孔斑点数为0-5个，且（抗原A或抗原B斑点数）-（空白对照 孔斑点数）等于5-7时，此结果被认为是“灰区”。
TB 抗原孔(B): CFP-10 (panel B)
阳性对照孔(P): 植物凝集素抗原(PHA)
(刺激所有T细胞都能释放r-干扰素)
IGRA中特异结核抗原 结核杆菌RD区特异抗原：
• ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原 • CFP-10: Rv3874 编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10
Rv3874 (CFP-10)
Rv3875 (ESAT-6)
Rv3871～Rv3879
试剂盒中结核抗原： ESAT-6和CFP-10的重叠肽段
RD-1 (M.TB毒力区)
结核分枝杆菌基因组
T-SPOT.TB检测试剂、组份
T-SPOT.TB检测试剂盒
无血清培养液AIM-V（分装使用）
组 份 可拆卸96孔板（8连条） 特异抗原A和B（ESAT-6和CFP-10）
γ-干扰素释放试验（T-SPOT.TB方法）
技术培训
培训内容
T-SPOT.TB 技术原理
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T-SPOT.TB 检测试剂、组份
T-SPOT.TB技术操作流程（SOP） T-SPOT.TB操作常见问题
γ-干扰素释放试验（IGRAs）
两种IGRAs用于商业诊断：
T-SPOT®.TB
(ELISPOT-based IGRA) Gold (ELISA-based IGRA)