第九章 表观遗传学研究实验技术简介

DNA甲基化分析技术
⑥甲基化敏感性单链构象分析 (methylation-specific single-strand conformation analysis， MS-SSCA) 原理 : 先用重亚硫酸盐处理待测片 段，针对非CG二核昔酸区设计引物 进行 PCR扩增，扩增产物变性后进 行非变性的聚丙酷胶凝胶电泳，由 于 DNA 电泳时的迁移率取决于其二 级结构即 DNA 的空间构象，而后者 又由 DNA 碱基的序列决定。因此， 经处理后变性的单链 DNA 将停留在 聚丙酷胶膜的不同位置上，这样甲 基化与非甲基化的就被分离开，随 后进行单链构象多态性加以分析。
染色体免疫共沉淀技术
染色质免疫沉淀技术的原理是 :在生理状态下把细胞 内的DNA与蛋白质交联在一起，超声破碎将染色质随 机切断为一定长度范围内的染色质片段，用所要研 究的目的蛋白特异性抗体沉淀交联复合体，再经过 蛋白质与DNA解除偶联，纯化目的片段并检测。
ChIP技术的步骤
(1)细胞固定:在活细胞状态下，用甲醒固定蛋白质 DNA复合 物，甲醒能有效地使体内的蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋 白质-RNA产生交联。
DNA甲基化分析技术
②重亚硫酸盐直接测序法 原理：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶， 而甲基化的胞嘧啶保持不变，之后进行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部 转化成胸腺嘧啶，最后，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较， 判断是否CpG位点发生申基化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法， 能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序， 过程较为繁琐、昂贵。
研究方法：⑪甲基化敏感的限制性内切酶法 ⑫重亚硫酸盐的甲基化分析方法
研究目的：⑪基因组整体水平甲基化分析
⑫特异性位点的DNA甲基化检测
⑬甲基化新位点的寻找
DNA甲基化分析技术
研究方法：⑪甲基化敏感的限制性内切酶法
一些限制性内切酶的识别位点中含有CpG双核苷酸序列，他们 往往只能结合非甲基化的识别序列，而对发生甲基化的序列 则没有结合活性。 这种方法不仅可以用来检测某个基因或DNA序列的甲基化状态， 而且可以用作整个基因组甲基化状态的筛查。 在这个原理基础上设计的研究方法有： RLGS (restriction landmark genome scanning，限制性标 志物全基因组扫描 ) 、 DMH (differential methylation hybridization for methylation analysis.差异性甲基化杂 交分析 ) 、 MCA Cmethylation CpG island amplification for methylation analysis，甲基化CpG岛扩增子分析)
②免疫化学法
此方法基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反应的原理。应用荧光素 标记抗体使之与预先己固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜 上的荧光素进行扫描得到5mC的水平，其荧光素强度与5mC水平成正比。 这种方法较为灵敏但需要精密仪器。
DNA甲基化分析技术
③Sssi甲基转移酶法
这种方法的缺点是 Sssi甲基转移酶不稳定，结果不够精确，另外这种方 法也是对DNA的整体CpG位点的甲基化情况检测，不能精确定位。
DNA甲基化分析技术
④氯乙醛法
首先，将DNA经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞唔院全部转变为尿嘧啶， 而甲基化的胞嘧啶保持不变 (Frommer et ai， 1992)，然后经过银或色 谱柱去除DNA链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5mC就转变 为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5mC的水平成正比。
将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与 标准品比较，测量254nm处的吸收峰值，计算内/ (5mC+5C)的积分面积就 得到基因组整体的甲基化水平。 这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示 目的片段中 CpG位点甲基化的情况。但存在的问题是不能对甲基化的 CpG 位点进行定位。
⑤
用LM-PCR扩增富集的DNA片段并用荧光染料(Cy5)进行标记; 未经免疫沉淀富集的 DNA片段也用LM-PCR扩增，但是用另 一种荧光染料(Cy3)标记扩增产物。 将这两组标记的DNA与一张含有全基因序列的DNA芯片进行 杂交。
⑥
⑦
从3次独立的实验获得的免疫沉淀富集的荧光强度与未经 免疫沉淀富集的荧光强度的比值用加权平均分析法计算目 的蛋白质与芯片中的每一段序列的相对结合度。
DNA甲基化分析技术
⑦甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳 (methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis， M5-DGGE) 原理：DGGE是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原 理，通过梯度变性胶将DNA片段分离开来的电泳技术。在由低 到高的变性梯度胶中，双链DNA片断依据其序列的特异变性点 溶化解链，单独的序列将在各自具特征的变性点开始解链。 当双链DNA片段迁移到变性凝肢的一定位置，达到解链浓度时， 开始部分解链，当迁移阻力与电场力平衡时， DNA片段在凝 胶中基本上停止了迁移，这样不同序列的DNA片段就被DGGE 有效分离。
DNA甲基化分析技术
③甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR)
其基本原理是用重亚硫酸氢纳处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧 啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性引物对所测基因的同一核昔 酸序列进行扩增。此原理的关键在于3对特异引物的设计。
DNA甲基化分析技术
(3) 染色质的免疫沉淀 z 利用目的蛋白质特异抗体通过 抗原 - 抗体反应形成 DNA 蛋白质抗体复合体，然后沉淀 此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段 ; 抗 体的量要进行优化，防止非特异的结合，同时要设立 相应的阴性对照，以验证抗体的有效性和抗原抗体反 应的特异性。
ChIP技术的步骤
ChIP on chip
ChIP on chip将ChIP操作与基因芯片技术分析法(chip)相结 合，是研究目的蛋白质与基因组中DNA相互作用位点的一种全 基因组定位方法。
实验步骤为：
①
用甲醒固定细胞
②
③ ④
超声破碎细胞
特异抗体通过免疫沉淀富集与目的蛋白质交联的DNA片段 解交联
ChIP on chip
DNA甲基化分析技术
DNA甲基化是表现遗传学的重要组成部分，在维持正 常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发 生中起着重要作用。随着对甲基化研究的不断深入， 其检测方法也层出不穷。这些方法针对不同研究目 的，运用不同的处理方法，几乎涵盖了从基因到基 因组各个层次水平的研究。
DNA甲基化分析技术
ChIP-Seq
ChIP-Seq技术将ChIP与第二代测序技术相结合，能够高效地 在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。 其原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富 集目的高通量测序；最后将获得的数百 万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围 内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
DNA甲基化分析技术
⑤结合重亚硫酸盐的限制性 内切酶法 ( c o mb i n e d b i s u l f i t e
restriction analysis，COBRA) DNA 样本经亚硫酸氢盐处理后， 利用 PCR扩增，扩增产物纯化后用 限制性内切酶（ BstUI) 消化。若其 识别序列中的C发生完全甲基化 (5 m CG5 m CG) ，则 PCR 扩增后保留 为 CGCG ， BstUI 能够识别并进行 切割;若待测序列中， C未发生甲基 化，则PCR后转变为TGTG， BstU I 识别位点丢失，不能进行切割。 这样酶切产物再经电泳分离、探针 杂交、扫描定量后即可得出原样本 中甲基化的比例。
第九章 表观ห้องสมุดไป่ตู้传学研究实验技术 简介

染色体免疫共沉淀技术 DNA甲基化分析技术

染色体免疫共沉淀技术
染色体免疫共沉淀 (chromatin immunoprecipitation. ChIP)是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位 点分析法，可用于测定体内结合在特定DNA序列上的 蛋白质。该方法主要应用于体内核小体定位、DNA甲 基化、组蛋白修饰等方面的研究。
④甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 (methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE) 原理是：先将研究序列用重亚硫酸盐 处理，未甲基化的胞嘧啶全部转化为 尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进 行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于 2管中，分别作为Ms-SnuPE单核昔酸引 物延伸的模板。设计用于 Ms-SnuPE 延 伸的引物的 3' 端紧邻待测碱基。同时 于 2 个反应体系中加人等量的 Taq 酶、 引物、同位素标记的 dCTP 或 dTTP 。如 果待测位点被甲基化，则同位素标记 的 dCTP 会在反应延伸时连于引物末端； 若是未被甲基化，则标记的 dTTP 参与 反应。未端延伸产物经电泳分离和放 射活性测定后可得出C/T值，即为甲基 化与非甲基化的比值，从而分析得到 待测片段中CpG位点甲基化情况。
DNA甲基化分析技术
⑧甲基化敏感性解链曲线分析( methylation-specific melting curve analysis， M5-MCA)
DNA甲基化分析技术
⑫重亚硫酸盐的甲基化分析方法
其原理是：用重亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催 化下处理DNA可使非甲基化的胞嘧啶发生脱氨反应， 从而转变成尿嘧啶 (U), 而甲基化的胞嘧啶不能发生 脱氨反应，因而仍保留为胞嘧啶。
DNA甲基化分析技术
研究目的：⑪基因组整体水平甲基化分析
①高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法
这种方法可以直接测定基因组整体 5mC水平。其优点是所用试剂价格低廉 且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一 种有毒的物质。
DNA甲基化分析技术
⑫特异性位点的DNA甲基化检测 ①甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP) 实验原理:由于Hpall和MsρI的识别序列相同(5'-CCGG-3')，但对甲基化 的程度不同，即Hpall不能切割双链甲基化的5mCCGG， C5mCGG和5mC5mCGG， 但能切基化的序列，而MsρI能切割C5mCGG但不能切害5mCCGG序列，因此 CCGG发生甲EcoRI/Hρall和EcoRI/MsρI的酶切、扩增产物产生多态性。 通过比较电泳谱带的差异，可以推测CCGG的甲基化情况。
原理：S-腺昔甲硫氨酸(SAM)在Sssi甲基转移 酶催化作用下使基因组DNA 的CpG位点发生甲基化，在体系中加人一定量的3H-S-腺苦甲硫氨酸(3HSAM)及Sssi甲基转移酶反应后，测定剩余的放射性标记的 S灿4即可得到 原基因组整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA甲基化水平成 反比。
(4)解除交联和纯化DNA:在免疫沉淀复合体中加入不 含DNase 的RNase 和蛋白酶K(也可以不加蛋白酶 K.解 除交联后回收 DNA. 蛋白还可用于做进一步的分析 ). 65 ℃保温6 小时使交联解除，得到 DNA. 并进行 DNA 的 纯化。 (5) DNA的检测:可以采用PCR、Southern杂交、ChIP 克隆、DNA芯片等方法进行DNA的检测。

其中使用甲醛作为交联剂的关键优势在于甲醒交联反应是 完全可逆的，便于在后续步骤中分别对 DNA 和蛋白质进行 分析。也可以使用紫外光作为交联剂来固定细胞，它比化 学交联剂产生更少的干扰，但难以广泛应用。
ChIP技术的步骤
(2) 化学 ( 微球菌酶 ) 或者超声破碎断裂染色质: 通常采 用超声波打断染色质，使其成一定大小的片段。目前 一般认为500-1000bp的大小范围是比较合适的。