PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

一、实验目的

1. 掌握PCR扩增技术的基本原理

2. 掌握PCR的常规操作

3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用

4. 了解PCR技术的应用

5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法

6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素

二、实验原理

1. PCR基本原理

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2. PCR反应体系

3. 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：①增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；②使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；③以0.5×TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长700bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与2Kbp的DNA相同。

三、实验仪器、材料和试剂

1. 仪器：移液器、离心管、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统

2. 材料：模版DNA 引物

3. 试剂：dNTP TaqDNA聚合酶 buffer

四、实验步骤

1. 按照以下顺序，依次添加入PCR管内

ddH2O 38.75 ul

10x buffer 5ul

dNTP 1.25ul

引物 1.25ul + 1.25 ul

模版 2 ul

Taq酶 0.5ul

2. 将配制好的PCR体系充分混匀后，离心。

3. 盖紧PCR管的盖子，插入PCR仪的孔内。

4. 设定好程序，开始PCR反应。

5. PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

五、注意事项

1. 换枪头，避免污染试剂

2. 酶置于冰上，且最后加入体系中。

3. PCR管的盖子一定要盖紧，以防蒸干。

4. 琼脂糖凝胶电泳，方向为阴极——阳极。

5. 一定要戴手套保护自己。

六、思考题

1. PCR反应体系中主要成分有哪些？他们分别起什么作用？

2. 为什么在PCR过程中要使用三个不同的温度？

3. 用PCR扩增目的基因，如何提高产物的特异性？

4. DNA在电泳过程中的迁移率取决于哪些因素？