发酵培养基灭菌

电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱
3、干热灭菌法
常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿
4、湿热灭菌法
利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121℃，30’ 适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 例：高压灭菌锅
5、过滤除菌法
利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气
1 N 0 2.303 N 0 t ln lg K Nt K Nt
注：
1）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈现非对数死亡
定律 ; 2）同一种微生物在不同的灭菌温度下，k值不同， 灭菌温度愈低，k值愈小；温度愈高，k值愈大。 3）如果要达到彻底灭菌，Nt等于0，则灭菌所需的 时间应为无限长，这在实际中是不可能的。 工程上，Nt=0.001，即在1000次灭菌中， 允许有一次失败;
减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死 亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，

dN KN dt
微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，
式中，N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s-1），也称反 应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关； dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。 积分得：
发酵培养基灭菌
第三章 发酵工业原料及其处理
• • • • 第一节 第二节 第三节 第四节 培养基的成分及来源 培养基的类型及选择 淀粉水解糖的制备 发酵培养基灭菌
1、培养基如何分类？ 在发酵生产中常用的固体还是液体培养基？ 2、说说培养基的六大营养要素？ 根据营养物质的来源不同，培养基可分为： 天然培养基、合成培养基和半合成培养基 根据培养基状态不同，可将培养基分成： 固体、液体和半固体培养基 根据培养基的用途(特殊用途)不同，可将培 养基分成：孢子\种子\发酵 增殖、选择和鉴别培养基
问题1 在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？
1、由于杂菌的污染，使生物反应中的培养物质因杂菌的消 耗而损失，造成生产能力的下降； 2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培 养液的某些理化特性，使产物 的提取和分离变得困难，造
成收率降低或使产品的质量下降；
3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物 反应发生异常变化；
一、灭菌的原理和方法
消毒与灭菌的区别？
消毒 杀死物体表面及内部一部分对人体有害的 病原菌的营养体，而对被消毒的物体基本 无害的措施，如对皮肤、水果、饮用水的 消毒，啤酒、牛奶、果汁等消毒。 灭菌 杀死任何物体内外的一切微生物的方法， 灭菌后的物体不再有可存活的微生物。
1、化学试剂灭菌法
化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒 2、射线灭菌法
答：从理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同 时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程 的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温 度的升高更为显著。 因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间， 这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损 失。
三、培养基的湿热灭菌方式
蒸汽 蒸汽 冷却水 无菌培养基
发酵罐
配料罐 泵 加热塔 维持罐 冷却管
蒸汽 T=140度 原料介质 真空
保温段
喷射加热连续灭菌流程
灭菌介质
流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直 接接触，从而在短时间内可将培养液急速升温至预定的 灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的 培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中 可以看出，由于该流程中培养基受热时间短，营养物质 的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先 进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。

Nt e kt N0
1 N 0 2.303 N 0 t ln lg K Nt K Nt
1 N 0 2.303 N 0 t ln lg K Nt K Nt
问题
在121度，枯草杆菌FS5230的K为0.047s-1， 梭状芽孢杆菌PA3679的K值为0.03 s-1 ，请问 哪一种微生物更耐热？
孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再30min便可杀
死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。
2、连续灭菌（连消）
1）定义：
将配制好的培养基在向发酵罐等培养 装臵输送的同时进行加热、 保温和冷却 而进行灭菌。
连续灭菌时，培养基可在短 时间内加热到保温温度，并且 能很快地被冷却 因此可在比间歇灭菌更高的 温度下进行灭菌 而由于灭菌温度很高，保温 时间就相应地可以很短 极有利于减少培养基中的营 养物质的破坏。
当培养基成分从T1上升到T2时，微生物的死亡速率与培养基的分解有如下 关系：
K2 ） K 1 E K `2 ln （ ） E ` K `1 ln （
通过实验测定可知： K2 （ ） 灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能值， ln K 1 E 因此： K2 K `2 K `2 ln （ ） ln （ ） ln （ ） E ` K1 K `1 K `1
湿热灭菌原理
121℃，30min。
灭菌条件 同时也会破坏培养基中的营养成分， 甚至会产生不利于菌体生长的物质。 因此，在工业培养过程中，除了尽可 能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可 能减少培养基中营养成分的损失
灭菌不利方面
1、衡量热灭菌指标
致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。 热 阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件 （主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻：几种微生物对热的相对抵抗能力。 指微生物在某一特定条件下的致死时间与 另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。
• 1、间歇灭菌（分批灭菌、实消） • 2、连续灭菌（连消）
1、间歇灭菌（分批灭菌、实消）
1）基本概念
发酵罐
定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装臵 中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌 的过程，通常也称为实罐灭菌。（常用）
150
温度
过程包括：升温、保温和冷 却等三个阶段。 各阶段对灭菌的贡献：20%、 75%、5%
100
保温 冷却
50
升温
0
80
120
160
240
时间（min)
各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%
从以上分析可知，灭菌过程中加热和保温阶段 的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次 要的，一般很小，可以忽略不计。 此外，还应指出的是，应当避免长时间的加热 阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而 且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从 而影响培养过程的顺利进行。
从上式可知，K值的大小与微生物 的种类与加热温度有关
灭菌时，培养基成分分解速率常数K`与温度之间的关系也可用 阿累尼乌斯公式表示：
K ` A`exp(
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
E ` ) RT
K`---培养基内易被破坏成分的分解速率常数； A`---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1； R---气体常数，8.314J/mol· K；T---绝对温度，K； ΔE`---培养基成分分解所需活化能，J/mol。
相对热阻
灭菌方式 干热灭菌 湿热灭菌 大肠杆菌 1 1 霉菌孢子 2-10 2-10 细菌芽孢 1000 3×105 噬菌体或 病毒 1 1-5
苯酚
甲醛 紫外线
1
1 1
1-2
2-10 5-100
1×109
250 2-5
30
2 5-10
从表中可看出
芽孢或孢子的热阻要比生长期营养细胞的热阻 大得多，这是由于芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量对 热阻的增加有关。另外，芽孢子中蛋白质含水量较 营养细胞低（特别是游离水分少），也是芽孢耐热 强的一个原因。
由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升 高温度灭菌。 结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时 间，这样便既可达到需要的灭菌程度， 同时 又可减少营养物质的损失。
问题
灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法 可以采用，一种是118℃灭菌15min，另一种是 128℃灭菌5min。哪一种方法好，为什么？
即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍 数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。 也就是说， 结论1：当灭菌温度上升时，微生物死亡速率的提高 要超过培养基成分的破坏速率的增加。
分析:在热灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和 培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速 度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率
在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高 的情况，这时可以适当延长灭菌时间。 生产上甚至有用100℃蒸煮而达到彻底灭菌的实例。
如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100蒸汽蒸
30min， 杀死其中的营养细胞， 但孢子与细菌的芽孢没 有被杀死。 将蒸过的原料臵于室温下过夜， 未被杀死的
随温度的升高更为显著。
据测定：每升高10℃时一般化学反应的反应速率 的增加倍数是1.5-2.0，而杀死芽孢为5-10，杀死 微生物细胞为35左右。
同样的灭菌效果
灭菌温度℃ 100 110 115 120 130 145 150 灭菌时间（分） 400 36 15 4 0.5 0.08 0.01 营养成分破坏% 99.3 67.0 50.0 27.0 8.0 2.0 1.0
4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；
5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败
问题2 1、为防止杂菌的污染，整个生化生产过程哪些需要注意
灭菌？ 培养基、发酵设备、空气、菌种制作
发酵培养基灭菌
• 一、灭菌的原理和方法
• 二、湿热灭菌原理