PVY研究进展

PVY研究进展
胡新喜1,2，何长征1,2，熊兴耀1,2，刘明月1,2，宋勇1,2，聂先舟3
（1.湖南农业大学园艺园林学院，长沙中国，410128；2. 湖南省马铃薯工程技术研究中心，长沙中国，410128；3.加拿大
农业部马铃薯研究中心，加拿大，E3B4Z7）
（1.College of Horticulture and Landscape，HNAU, Changsha,410128,China. 2. Hunan Potato Research Centre, Changsha,410128,China . 3.potato research centre of Agriculture and Agri-Food Canada ，Fredericton, NB, E3B4Z7,Canada）摘要：PVY是危害马铃薯的最重要病毒之一。

从PVY多样性、致病机理和植物抗PVY研究对有关PVY 的研究进行综述，并对今后的研究重点进行了展望。

关键词：PVY多样性
Abstract: Potato virus Y (PVY) is one of viruses that are most widespread and economically destructive to cultivated potato. Researches on PVY diversity, pathogenic mechanism and plant resistance to Potato virus Y were summarized in this article. Researches that should be studied thoroughly were previewed.
Key words: PVY ; Diversity; Pathogenicity ; Resistance
马铃薯是世界主要作物之一。

马铃薯适应性强，产量高，不仅粮菜兼用，还是优良的加工原料，可加工成薯片、薯条、淀粉和酒精等多种产品，用途广泛、产业链长。

全球每年有近两千万吨淀粉原料直接投入工业生产，涉及食品、医药、纺织、化工及造纸业等众多工业领域，目前用作工业原料的淀粉主要来自玉米和马铃薯。

目前全球马铃薯种植总面积约1900万公顷，总产量近3亿吨，仅次于水稻、小麦、玉米，位居第四。

中国是世界第一大马铃薯生产国，种植面积占全球的25％，总产约占全球的20％。

但是，马铃薯病害特别是病毒危害严重，给马铃薯生产带来很大的损失。

马铃薯病毒能引起马铃薯种质退化，产量降低，最严重的减产达90%以上。

侵染马铃薯的病毒及类病毒多达25种以上，但是危害严重的只有几种，如马铃薯卷叶病毒（potato leaf roll virus, PLRV）、马铃薯Y 病毒（potato virus Y, PVY）、马铃薯X病毒（potato virus X, PVX）、马铃薯纺锤块茎类病毒（potato spindle tuber viroid, PSTVd）。

这些病毒与类病毒在世界范围内普遍发生，其中PVY是感染马铃薯的病毒中最为广泛并造成严重经济损失的病毒之一。

马铃薯Y病毒属（Potyvirus）是最大的植物病毒种类之一，具有长约700-750nm弯曲的线状病毒颗粒，每个病毒颗粒都含有一套完全基因组，其基因组是由大约10000个核苷酸组成的单链正义RNA分子，它属于类细小核糖核酸病毒超群。

基因组中开放阅读框的两端含有终止非编码区( nontranslated region，NTR)，单一的大的多蛋白在翻译后自我分解为VPg （virus-encoded genome linked protein）、P1、HC-Pro（aphid transmission helper component protease ）、P3、CI（cylindrical inclusion protein）、6K1、6K2、NIa (nuclear inclusion a protein)、NIb (nuclear inclusion b protein)、CP（coat protein）等蛋白质[59]。

PVY（Potato virus Y)是Potyvirus的典型成员之一，最初来自茄科植物，寄主非常广。

PVY 主要危害马铃薯，因寄主品种和病毒株系不同，可使马铃薯发生不同程度的症状，可造成马铃薯高达80%产量损失[31,55,78]，因此它与马铃薯卷叶病毒一样被认为是感染马铃薯的病毒中传播最为广泛、造成经济损失最为严重的病毒之一。

PVY在全球广为传播，能由蚜虫以非持久方式传播，同时还能感染辣椒、烟草和番茄等作物，因其最初侵染寄主不同可分为马铃薯株系和非马铃薯株系[11,63]。

本文将从株系多样性、致病机理及植物抗PVY等方面对近几年的研究进行简要综述并探讨今后研究的重点。

1、PVY多样性
自1931年Smith首次命名PVY以来，至今共发现了128个已知种和有89个暂定名种[26]，并不断有一些新的未知的PVY株系被发现、进化并传播到一些新的地区[10,38,39,45,46,56,83,84]。

PVY多样性研究主要包括寄主植物反应、血清学特征和分子特征等方面。

1.1 PVY寄主植物反应的多样性
根据寄主植物反应，目前发现的PVY主要为分以下几种类型：PVY N，PVY O，PVY C，PVY Z，PVY E[36]（表1）。

早期研究者根据PVY能否诱导通过嫁接接种的不同马铃薯品种顶端坏死或摩擦接种烟草诱导系统
坏死或过敏性反应，分为不同的株系。

PVY C能诱导带有抗性基因Nc的马铃薯品种顶端坏死、PVY O能引起带有抗性基因Ny的马铃薯顶端坏死，PVY N能诱导烟草系统性坏死但不能引起含有Nc or Ny马铃薯品种过敏性反应、PVY Z能引起可能带有Nz的马铃薯坏死、PVY Z不能引起带有Ny、Nc和Nz的马铃薯坏死也不能引起烟草坏死。

其中以PVY N的危害最为严重，传播范围最广。

表一PVY株系的基本特征
株系组群株系寄主反应血清学反应
PVY O PVY O 烟草花叶,引起可能带有Ny的马铃薯
坏死
PVY O,C血清抗体
PVY N Eu-PVY N烟草叶片明脉坏死PVY N血清抗体PVY N:O or PVY N－Wi烟草叶片明脉坏死，PVY O,C血清抗体NA-PVY N烟草叶片明脉坏死PVY N血清抗体Eu-PVY NTN烟草叶片明脉坏死, PTNRD PVY N血清抗体NA-PVY NTN烟草叶片明脉坏死，PTNRD PVY N血清抗体
PVY C PVY C引起可能带有Nc基因的马铃薯坏死PVY O,C血清抗体PVY Z PVY Z引起可能带有Nz基因的马铃薯坏死PVY O,C血清抗体
PVY E PVY E 不能引起带有Ny、Nc和Nz基因的马铃薯坏死也不能引起烟草坏死
PVY NTN是PVY N的一种表型，上世纪80年代在欧洲被发现，它们中的一些能诱导马铃薯块茎坏死环斑病（potato tuber necrotic ringspot disease, PTNRD）[10,38,41,43]，随后在北美、亚洲大洋洲发现了能诱导敏感品种发生马铃薯块茎坏死PVY株系[49,51, 65, 77]。

但是产生PTNRD的特征是多变的，一是感染这种病毒的马铃薯只有50-70%的块茎表现出PTNRD症状[10]，二是一些在大田环境下感染PVY NTN后表现出PTNRD症状品种在温室条件下其并不表现出PTNRD症状[80]，三是一些从没有症状的块茎上分离的PVY N，并且不知道能否在大田条件下促使发生PTNRD症状，但是，在温室条件下能使块茎产生坏死[15]。

因此，对这些株系及其诱导马铃薯发生PTNRD症状的各种条件需要进行深入系统的研究。

1.2 PVY血清学特征
利用单克隆抗体技术可将PVY分成两个主要的血清群组：PVY O,C血清型，包括PVY O，PVY C,PVY Z 和PVY N－Wi（北美称PVY N：O）,另外一个是PVY N或PVY N/NTN血清型，包括了PVY N和PVY NTN。

McDonald 等描述的MAb2抗体能识别PVY O和PVY C株系，且与PVY N没有任何交叉反应[46]。

Illis等报道的1F5抗体能区分所有的PVY N除少数PVY O有交叉反应[25]。

Chikh等发现叙利亚PVY株系能同时与Mab2和1F5两种抗体反应[19]。

在波兰、加拿大和西班牙同样也发现一些能诱导烟草发生明脉坏死症状的PVY N变种如PVY N-Wi（北美称PVY N：O）与PVY O专一单克隆抗体反应。

但是针对各种类型PVY血清学研究的基于外壳蛋白的单克隆抗体技术至今还未完全建立起来。

现在还没有证据证明外壳蛋白（CP）对烟草发生花叶或者明脉坏死症状负责或者识别植物的抗性基因，单独利用血清标准来鉴定PVY存在很大的风险。

1.3PVY分子特征
随着分子生物学与生物技术的发展，一些PVY基因组全序列或部分序列被克隆和测序[45,49,51,53,68,71]，研究PVY的重点从研究寄主植物反应转向分析PVY的核酸序列差异或分子特征及研究PVY与寄主分子互作。

经序列分析和RT-PCR、RT-PCR-RFLP检测，结果表明，一些PVY N的变种是PVY O和PVY N的重组体，最典型的能诱导PTNRD的欧洲型PVY NTN（Eu-PVY N TN）是PVY O和PVY N在HC-Pro/P3、6K2/NIa 和CP编码区发生了重组，有三个重组位点[31,52,76]。

PVY N-Wi（北美称为PVY N：O）亦被证明是PVY O和PVY N 在HC-Pro编码区发生了重组，有一个重组位点或两个重组位点，甚至有些类型具有四个重组位点[12,21,30,52,53,65]。

有研究发现PVY N-Wi能诱导敏感品种发生马铃薯块茎坏死，新西兰非重组型PVY N[65]和北美非重组型PVY NTN（NA-PVY N TN）[49,51,77]也能诱导敏感品种的块茎发生坏死。

因此，到目前为止还不能理解究竟基
图1.PVY 分子结构的模型图
因组的哪一序列或结构域对块茎坏死负责。

令人感动惊奇的是，在西班牙发现两个PVY 的变种PVY Z ，能被PVY N 专一的RT-PCR 引物检测、血清学对PVY O 专一的单克隆抗体反应却不能诱导烟草产生明脉坏死症状，不同于普通重组型的PVY N 如PVY N:O 和PVY N TN[13]。

随着研究的不断深入，越来越多重组型PVY 株系以及不同个数重组位点被发现和证实（图1），在德国和美国先后发现了NA-PVY N/NTN 和Eu-PVY N 重组型PVY [56,45]。

笔者等2007年在湖南发现了2个PVY 株系（ PVY -HN1、PVY -HN2），在温室条件下能诱导马铃薯Y ukan Gold 发生典型的PTNRD 症状，用Nie 等[58]针对Eu-PVY NTN 三个重组位点的三重RT-PCR 检测，结果发现，PVY -HN1三个重组位点，与Eu-PVY NTN （PVY NTN –Hun ）相同[71]，而PVY -HN2只有两条带，似乎只有两个重组位点。

经进一步克隆和测序，并经ClustalW2 [42]比对和SimPlot 程序[44]分析，发现PVY -HN1、PVY -HN2基因组长9702bp ，为典型的有三个PVY N 和PVY O 重组位点的重组型PVY ，但是PVY -HN1只有第二、三个重组位点与PVY N TN
–Hun 相同，PVY -HN2只有第二个重组位点与PVY NTN –Hun 相同，PVY -HN2的第一个重组位点和第三个重组位点比PVY NTN –Hun 的相应重组位点分别向后移动100bp 和向前移动610bp ，分别位于~nt 2,520和 ~ nt 8,570处。

PVY -HN1的第一个重组位点与PVY -HN2相似，位于~nt 2,507。

利用生物信息技术对PVY 全基因组序列或部分序列进行比对和分析已成为深入研究了PVY 的进化、多样性及PVY 地理起源的重要手段[45, 56 ]。

2、PVY 致病机理研究
人们对Potyvirus 的致病力分子机理和寄主反应进行了一些探讨。

绝大部分Potyvirus 能诱导显著的症状，症状特征及严重程度取决于病毒和特定株系以及可能影响寄主生理和发育的环境条件。

症状是寄主与病毒之间复杂的细胞和超细胞的相互作用的结果。

一般而言，对任何亲和性寄主和病毒组合来说症状的严重性将反映病毒复制和积聚的水平。

Potyvirus 基因组几个区域在症状形成中的作用已被证实。

TVMV(Tobacco vein mottling virus )基因组突变分析证明P1/HC-Pro 编码区特别是P1/HC-Pro 的5` 端编码区参与了烟草症状表现[4,5,40]。

Johansen 等通过构建两个PSbMV(Pea seed-borne mosaic virus )株系的重组杂
非重组型PVY
PVY C : Adgen
PVY O : O-139
Eu-PVY N : CH-605
NA-PVY N/NTN : N-Jg,TU660
重组型PVY
PVY N:O : Mb112 PVY N:O : iso15 PVY NTN
:v942490 PVY NTN :HN2
PVYNTN :156 PVYNTN :156vari PVYN* :Nicola PVYN* :NE-11 Nnp NC-57 6K1
6K2
种证实编码PSbMV的NIa和NIb蛋白片段对豌豆症状的严重性有重要影响[35]。

两个分离的TEV(Tobacco etch virus)基因组片段，一个覆盖P3蛋白编码区的3’端，另一个覆盖CI、6K的3’端和NIa编码区的5’端，一起对Tabasco辣椒的萎焉症状负责[22]。

同时在PPV（Plum pox virus）的P3-6K1切割位点插入突变引起症状变轻或更加严重[60]。

进一步研究PPV表明5’NTR缺失127到145核苷酸只能诱导克利夫兰烟产生较轻的症状[67]。

在TVMV的3’NTR，14个腺嘌呤和尿嘧啶的四次重复结构对烟草上症状减轻负责[61]。

尽管如此，现在仍然还不可能用同一的原理来解释症状的形成。

虽然在其他病毒属中有一些特异的病毒基因产物在没有接种的情况下起到症状诱导子的作用[6,17,57]，在Potyvirus还没有此类证据。

随着酵母双杂交系统和生物分子荧光补充分析等技术应用，一些病毒蛋白和寄主蛋白的相互作用如Potyvirus的VPg 与植物的eIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E)的相互作用[20,79]、Potyvirus（包括PVY）的Hc-Pro与拟南芥的20S蛋白酶体的相互作用[7,81]、PVY的Hc-Pro与烟草叶绿体形成有关的NtMinD蛋白的相互作用[82]、PVY的CP与烟草胞间连丝运输有关的NtCPIP之间的相互作用不断被证实[24]。

多种Potyvirus病毒的协同侵染分析表明，Hc-Pro通过干扰寄主限制病毒侵染的防卫反应起到致病力增强子的作用[58,66,73]。

多个平行系列研究表明，Hc-Pro能抑制转录后基因沉默（post-transcriptional gene silenc ing，PTGS），造成病毒复制量得到提高，将表达P1/HC-Pro转基因株系和报告基因(uidA、gfp)出现PTGS的转基因株系杂交，报告基因的功能在其后代得到了恢复[2,37]，表达HC-Pro 的PVX(Potato virus X)载体在转基因系体内的表达水平比野生型PVX高并且能恢复被沉默的报告基因的表达[2]。

另外一些证据说明Hc-Pro中心区介导了共侵染的协同作用和基因沉默的抑制以及Hc-Pro的这种特性因为P1蛋白的存在得到加强[2,37,66]。

因此，PTGS被看作是寄主潜在的防卫机制，这种机制能限制病毒在感染细胞的积聚，从而延缓病毒的移动[8,9,58]。

由于我们对病毒蛋白的功能了解相对清楚，对症状表现理解的不够从一定程度上反映我们对与病毒蛋白相互作用的寄主蛋白及其相关基因理解的缺乏。

寄主基因表达分析表明，PSbMV侵染豌豆组织抑制了一些寄主基因的表达也选择性地诱导了一些基因（如hsp70、多聚泛素）的表达[3,75]；PVY引起寄主一些病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PR)如PR1的表达差异[48,54,62]。

随着基因芯片技术、real-time PCR 、计算机辅助功能基因组分析等技术的应用和飞速发展的植物基因组研究成就将推进potyvirus生物学基础和应用领域的研究。

3、植物抗PVY研究
由于PVY对马铃薯的产量、质量造成较大的影响，保护马铃薯不受PVY的侵染可采取选育抗性品种、控制生物载体、使用脱毒种薯和减少传播的栽培措施。

选育抗性品种是一个相对经济、持久、可靠的途径。

在马铃薯野生种和栽培种中都已发现抗PVY的基因，通常分为极端抗性(extreme
resistance ,ER) 和高敏抗性( hypersensitive resistance , HR)两类，极端抗性几乎对所有的PVY株系都具有抗性，能阻止病毒在侵染早期的繁殖,用抗病植株进行病毒侵染试验时，几乎观察不到感病症状或者检测不到PVY；而高敏抗性基因则针对特异的PVY株系表现出抗性，例如Ny引发PVY O过敏抗性，马铃薯野生种和栽培种均具有对PVY O或和PVY N的高敏抗性[ 23,36]，它的特征是在接种叶的起始侵染部位发生坏死斑，是对病毒侵染后局部细胞坏死的一种快速防卫反应,以防止病毒扩展，但是有关它的抗性机理还不清楚。

一些情况下，过敏抗性被启动，但不能限制病毒在植物组织内的移动而导致形成更大的坏死病斑、明脉坏死、接种叶的致死性坏死。

许多抗病毒病基因己经被定位到马铃薯不同的染色体。

控制这种过敏抗性的基因被称为N基因[72 ]。

Vidal 等从马铃薯XI染色体分离到N型基因Ny-1基因并将获得能产生过敏反应的转Ny-1马铃薯[74 ]，此外Szajko等在马铃薯的IX号染色体上定位了Ny-1基因[70 ]。

Celebi-Toprak等从马铃薯IV染色体上分离到N型基因Nytbr基因[ 18]。

马铃薯XI 染色体远北端含有一个富含抗性基因的区域或称为抗性热点(Gebhardt and Valkonen 2001) [29]。

抗PVY的极端抗性基因Ryadg被定位到XII和XI号染色体（Brigneti et al. 1997）[14 ]。

Rychc基因被定位到马铃薯IX 染色体(Sato et al. 2006)[64]。

Rysto或称Ryf-sto被定位到马铃薯XI 号染色体[14]。

与上述两种抗性基因不同的辣椒pvr等位基因编码与PVY的VPg相互作用、抑制病毒复制和移动的
eIF4E蛋白，是由III号染色体上的隐性基因（pvr1、pvr2和pvr5）[16,47]或X号染色体上的显性基因（pvr4 和Pvr7）控制的抗性[32]，符合基因对基因假说，抗性的产生是由于病毒和植物作用因子的非亲和性作用的结果。

自从最早表达TMV外壳蛋白的转基因烟草获得TMV抗性以来，利用转基因途径获得PVY抗性已被广泛研究。

将PVY外壳蛋白基因和P1基因导入到马铃薯获得PVY抗性[1]。

最先报道的转基因植物都是通过蛋白质诱导的，缺乏最近研究的由基因沉默诱导的抗性稳定和持久。

这些方法是利用特殊的设计的结构产生发夹RNA。

在植物细胞内，小分子双连RNA (short double-strandedRNAs, siRNAs)从这些结构产生，而这些小分子siRNAs 能激发转录后基因沉默，但是Gargouri-Bouzid等人研究表明CP蛋白和RNA都能诱导马铃薯产生PVY抗性[29]。

4、展望
随着分子生物学技术的发展和马铃薯产业的需要。

笔者认为有关PVY的研究方面重点放在一些几个方面。

一是研究PVY与植物的分子互作，进一步阐述PVY致病的分子机理和植物抗病的分子机理。

二是要重视抗病毒病遗传研究，加强在抗病毒病资源改良和抗病毒病品种选育方面的工作，充分利用丰富的二倍体资源来拓宽育种资源的遗传背景。

常规育种应逐渐摆脱经验主义，借助现代技术手段，从依靠表现型选择向基因型发展。

生物技术尚有其局限性，对少数基因控制的基因的改良尚可，对由多数基因控制的经济性状的改良还需要依靠常规育种。

育种者在开展常规育种的同时，要紧密关注生物技术的发展，将一切成熟的可提高育种效率的生物技术方法和手段都用于常规育种。

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