阿尔茨海默病动物模型建立方法的论述_薛斌

基金项目:成都医学院“实验室开放基金课题”资助(S YSKF200748)。

作者简介:薛斌(1984-),男,成都医学院2005级临床本科班学生,研究方向:小鼠空间记忆障碍时效关系研究。

△通讯作者:荣成(1980-),男,助教,
成都医学院基础医学实验技术中心科研秘书,研究方向:小鼠空间记忆障碍时效关系研究。

阿尔茨海默病动物模型建立方法的论述
薛　斌1　荣　成　张　晓2　杨　拯2　江红丽2
(1.成都医学院2005级临床本科甲班　2.成都医学院实验技术教研室)
[摘　要]学习记忆能力障碍是老年性痴呆(Alzheimer ’s disease,AD)的主要临床症状和特征,而目前对阿尔茨海默病的发病机制有三种有影响力的学说。

因此理想的阿尔茨海默病AD 动物模型,对研究该病的发病机制及治疗具有重要意义,本文就目前几种有影响力的AD 的动物模型研究现状作一综述。

[关键词]阿尔茨海默病　穹窿海马伞　胆碱能神经元　T au 蛋白　β-淀粉样肽
阿尔茨海默病(Alzh eimer ’s disease ,AD )是一种临床常见的中枢神经系统变性疾病,目前其发病机制有三种影响力的学说,如淀粉样蛋白学说、乙酰胆碱能学说、线粒体损伤学说。

现关于AD 疾病的研究日益受到国内外学者的高度重视。

其建立一个可靠的A D 动物模型是研究AD 的重要环节。

有关AD 动物模型建立的方法较多,各有利弊,本文针对这几种学说的AD 动物模型的建立和新的动物模型的建立作一综述。

一、自然衰老认知障碍AD 动物模型
AD 是一个与年龄相关的疾病,衰老因素在AD 发病过程中扮演着重要角色,衰老所特有的病理生理变化及其它病变的影响,是用年轻动物制作的动物模型所不能替代的。

通过行为筛选的方式,选择带有认知和记忆严重缺失的个体,它们的行为损害与老年人和A D 患者的认知损害相类似,同时还可出现某些相应的脑组织病理改变[1]。

故是研究AD 较好的动物模型。

但存在以下缺点:①老年动物神经系统的发病与A D 的发病机制过程不完全一致,因此神经化学方面的改变也是不同的。

②体质差,易死亡,故不宜用于周期长的实验。

③对药物的吸收代谢不佳。

④价格昂贵。

所以该模型的应用受到一定限制。

二、损害模型的AD 动物模型1.断开穹窿海马伞通路模型
早在1954年,Daitz 等人就采用横断穹窿海马伞系统来研究观察神经元的退化过程。

后来人们为了进行AD 方面的研究,采取了真空抽吸、横断或电解等方法损毁单侧或双侧穹窿海马伞通路建立AD 模型[2-3]。

此种方法主要是通过切断隔海马通路(如扣带束、背穹窿海马伞),破坏胆碱能及非胆碱能纤维传入,导致实验动物行为及神经化学方面的缺损,造成动物空间定向和记忆障碍及胆碱能神经元的丢失。

1994年在此基础上,Jeltsch 等的实验研究结果表明,切断双侧穹窿海马伞通路造成的A D 模型在数月后其行为及神经化学的缺失也不能恢复[4]。

该模型是建立在“AD 认知障碍的胆碱能假说”的基础上,基底前脑的胆碱能细胞发出轴突广泛地投射到新皮质和海马等高级脑区,这一投射与学习记忆和认知功能有着密切的联系。

在任何一个环节阻断或损坏这一投射系统都可导致动物认知障碍和学习记忆能力的损害。

其病理检查发现A D 患者基底前脑的胆碱能细胞出现严重溃变,其细胞丢失的程度和患者的认知能力成负相关关系[5]。

如通过手术、化学或免疫切除的方式损伤基底前脑——海马胆碱能投射,来模拟AD 的前脑胆碱能系统的损害,可用于①研究前脑胆碱能系统选择性损害对AD 的记忆减退与认识障碍的临床症状的关系的研究;②拟胆碱药物治疗A D 的药物筛选、疗效评价和作用机制的研究;③胚胎基底前脑胆碱能细胞脑内移植治疗AD 的实验研究;④神经营养因子如N G F 等脑室投递治疗A D 的研究以及N GF 或其它神经营养因子基因修饰细胞脑内移植对A D 进行基因治疗的研究等。

用此方法
建立A D 模型,周期短(约两周),但手术定位难以控制,很难避免手术区邻近组织的受损。

故此方法基本不再运用。

2.慢性缺血痴呆模型
脑的供血不足可以导致脑损伤和一系列的临床症状,加拿大学者To r re 报告用老年动物慢性脑缺血模型引起的行为缺失和脑组织病理生理改变在许多方面与人类的老年期痴呆包括AD 相类似[6]。

慢性缺血痴呆模型是通过结扎老年大鼠的双侧颈总动脉和一侧椎动脉或者一侧锁骨下动脉,造成脑的长期供血不足和相应的脑损害,这些脑损害与AD 的临床表现和病理改变有一定相似性[6]。

其特点为:①脑组织长期供血不足;②只有老年动物长期缺血才出现恒定的行为损害和病理改变,年轻动物长期缺血造成的损伤是一过性的。

基于该模型的制作机理和特点,考虑到临床上有不少AD 患者同时合并有脑血管型痴呆和脑供血不足,我认为这一模型适用于研究混合性老年期痴呆的发病机制和有关药物治疗的研究。

3.鹅膏蕈氨酸(Ibo tenic acid ,IBO )损害模型
IBO 是一种谷氨酸受体激动剂,具有强烈的神经兴奋毒性作用,通过与神经元胞体或树突上的N M DA 受体相结合导致神经元中毒性损伤而溃变。

基于基底前脑神经元丢失在衰老和AD 有关的认知缺失中的重要作用,以谷氨酸类似物微量注射到基底前脑导致其神经元溃变和认知缺陷。

制作A D 模型最常用的谷氨酸类似物主要有海仁酸(Kainic acid,K A)、IBO 和使君子氨酸(quisqualic ,Q U IS )。

其中以IBO 最为首选,尽管IBO 和Q U I S 都能造成基底前脑胆碱能神经元溃变,但只有IBO 能恒定地损害动物学习记忆有关的行为执行。

基底前脑细胞对K A 的敏感性较低,故用量较大,易引起动物死亡,并往往在导致基底胆脑细胞损害的同时引起其它部位神经元(如海马锥体细胞)的死亡[7-8]。

4.Okadaic acid 慢性损害AD 模型
Okadaic acid(O A)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的特异性抑制剂,O A 的长期脑室投递可引起动物的记忆严重缺失,同时导致脑内A β淀粉样沉积斑块形成以及N F T 样磷酸化Tau 蛋白出现。

O A 损害模型是利用O A 对丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的特异性抑制作用,以及它对蛋白激酶C (PK C )的激活作用。

丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的抑制可以使T au 蛋白过磷酸化,导致N FT 的形成。

同时,PK C 激活,丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的活性抑制,可剌激A β产生,进而引起A β的沉
积和老年斑的形成[9]。

由于O A 对蛋白磷酸化酶,丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的抑制作用和提高PK C 的活性,并能同时复制出AD 的二大分子标志有关的病理改变——老年斑和N F T ,该模型具有明显的优势主要适用于:①研究AD 发病的病理机制,A β和Tau 蛋白代谢异常与A D 病理的关系,以及A β和Tau 在AD 病变中的相互作用。

②从另一角度验证现有AD 治疗方法
—
16—
和药物的疗效。

5.铝元素中毒模型
正常人脑组织铝的含量1.8±0.8μg/g(干重)或1.22μg/g (湿重),正常大鼠脑内铝含量为1.1μg/g(干重)[10-11]。

已被公认,铝在体内一些部位的异常蓄积可产生毒性作用。

早在1937年Sch erp和Church就提出铝可引起神经元退化的看法[11]。

1965年Klatzo和Ter ry等提出铝中毒可能与AD发病有关,他发现A D病人与铝中毒病人脑中均可见N F T[12]。

此后1973年Cra pper等人提出铝可能是神经毒素,他们给猫脑内直接注射铝盐,发现铝具有神经毒素样作用,导致神经纤维变性[13]。

国内有学者采用给大鼠[正常大鼠脑内铝含量为 1.1μg/g(干重)[10-11]]或小鼠腹腔注射或口服铝盐建立AD模型[14],结果模型鼠出现大脑重量减轻,学习记忆减退表现。

临床资料表明A D 病人脑内铝含量显著高于正常值[15];血清铝的水平也明显高于对照组[16]。

纵观有关铝与AD的实验研究,已基本肯定:AD病人脑内铝的含量明显超过正常值;铝对中枢神经系统有毒性损害,使神经元变性或死亡,产生N F T病理性改变,继而表现为大脑皮质萎缩,脑重减轻;出现记忆、认知功能障碍。

有关铝和β-淀粉样肽关系的研究,结果表明铝可以引起β-淀粉样肽在脑内沉积和β-淀粉样前体蛋白在神经元的过度表达[17-18]。

因此,我认为,用铝诱导建立A D模型的方法较好。

缺点是此种A D模型出现的N F T与AD病人的略有差异,再就是用铝造模周期长。

6.Aβ注射模型
SP是AD的重要病理学改变之一,Aβ是SP的主要成分。

越来越多的实验证明Aβ在A D发病中起重要作用。

体外实验证明Aβ在μmol/L浓度时即对神经元产生毒性作用。

脑内急性注射Aβ可使动物产生与A D相似的行为障碍和记忆缺损症状,并出现Aβ沉积。

所以,急性注射Aβ目前是一种较好的动物模型,常采用的方法有海马内单点注射、海马内多点注射等[19-20]。

Aβ1-40海马注射AD模型为在体水平研究Aβ介导神经损伤的神经病理机制提供时间和空间上较易控制的条件。

此种模型可迅速建立学习记忆障碍,损毁部位明确,与学习记忆相关海马脑区锥体细胞丢失明显且局限,而且可以通过调整Aβ注射量来控制模型的行为与组织病变程度。

另外也为后期的细胞定位移植治疗模型提供适宜的模型条件[21-22]。

Aβ1-40单侧海马注射AD模型大鼠尽管可以模拟人类AD疾病的部分特征病理改变,但是不能模拟疾病渐进性的病理学改变。

三、转基因型AD动物模型
关于转移基因小鼠的研究始于八十年代末,1991年Q uo n 等人先后进行了有关报道[23]。

在1993年第23届美国神经科学年会上Felenstein等报告了建立转移基因大鼠模型。

1995年美国Athena neuro siences Inc and Eli Lilly&Co.公司宣告用遗传工程方法建成了AD动物模型,即转移基因小鼠。

他们采用人体异常App的基因向小鼠胚胎细胞插入而建立的。

App基因是编码淀粉样蛋白的基因,这种蛋白在体内能释放出β-淀粉样肽,β-淀粉样肽在AD患者脑内老年斑中大量存在。

与上述所有方法相比,此种模型能较好模拟出与AD有关的记忆损害和形态变化。

AD转基因的动物模型近年来的进展非常迅速,各种A D 转基因模型不断被报道。

现有的模型大多数是将不同结构的App基因转移到受精卵,但真正理想的转基因模型尚不多见。

Ga mes D等(1995)报道了App突变体(V al717-Phe)转基因小鼠,显示了老年斑、Aβ沉积等A D的病理改变,该模型认知能力尚不清楚。

转基因鼠(JU)表达人野生型App751,显示了空间记忆的损害,但只有4%的转基因鼠饲养到12个月以上才展示了Aβ的沉积,且Aβ沉积的量很少,不能被刚果红染色[24]。

转基因AD动物模型是建立在App基因突变导致Aβ沉积是AD病理改变的中心环节的学说的基础上。

用实验的方法将外源性App 基因(野生或突变型)导入,使其在染色体基因组中稳定整合、表达,并遗传给后代。

动物过多地表达App基因或其突变基因产物,引起Aβ的沉积和相关的病理损害或临床症状。

转基因的方法能够直接试验是否野生型或突变型的App,或者Aβ包含片段的过度表达是A D的病因,近年来这一领域的研究非常活跃[25]。

鉴于AD是多基因遗传疾病,病因涉及到多个基因的参与,诸如早老素(PS21,PS22)、淀粉样蛋白前体蛋白(App)、载脂蛋白E基因(APO E)、α2巨球蛋白基因(A2M)等[26]。

研究者们开始构建两基因甚至三基因突变的小鼠模型[27]。

PS1/App转基因小鼠不仅脑内出现Aβ沉积形成神经斑块的时间早,而且Aβ沉积的量多,分布广,伴有神经变性与丢失以及行为功能改变[28],是研究AD较好的模型。

转基因技术通过转入AD基因调控成分建立整体模型,可以在复杂的内环境中再现或模拟AD某些病理表现。

它可以验证有关AD病因机制等的各种假说,为临床药物研究提供有效实验依据,继而找到确切的治疗靶位,较之于目前其他动物更有效。

总之,AD的动物模型有多种类型,大致可概括为损害模型、自然衰老模型和转基因动物模型三大类。

每一种模型都在一定的程度上或某些方面模拟了AD的症状和病理改变。

它们各自具有自己的适用范围和作用,又各有优势和不足。

因此,每一个需要应用AD动物模型的研究者,首先必需熟悉AD的基本病理改变和临床表现,了解各种模型的原理和特点,根据自己的实验目的选择合适的模型。

近年来,AD动物模型的研究进展非常迅速,随着我们对A D发病的细胞分子机制认识的不断深入,新的动物模型将继续出现。

现有动物模型也将不断得到改进,而AD动物模型制作和研究的进展,又将进一步促进我们对AD 的发病机制的了解和推动其药物治疗研究的进步。

参考文献
[1]Donald L P a nd Sang ram SS.Cellula r and molecular bi-o log y o f Alzheim er’s disea se and animal models.A nn.Rev.M ed 1994,45:435-436
[2]Gag e F H,Bjo r kund A,Ste nevi U,Reinne rv a tio n o f the pa rtia lly deaffere nted hippo ca mpus by compensa to ry co llater al spr outing fr om spar ed cho linergic and nor adrenergic a fferents. Br ain Res,1983,268:27
[3]Dunnett SB,N eural tra nsplanta tio n in animal models of dementia.Eur J neuroa ci,1990,2:567
[4]Jeltsch H,Cassel JC,N eufang B,et a l.The effec ts of in-tahip-po ca mpal taphe and/or septa l g rafts in ra ts w ith fimbria -fo rnix lesio ns depend on th e g rafted tissue and the be-havio ural task used.N uero science,1994,63(1):19
[5]M cGee r PL,M cGeer EG,Suzki J,et al.Aging, Alzheimer’s disea se,a nd the cho liner gic system of the basal for ebrain.N eur olog y,1984,34:741-745
[6]To r re JC,Fo rtin T,Pa rk G A S,et al.Chro nic cere-br ov ascular insufficiency induces dem entia-like deficits in ag ed ra ts.Brain Res,1992,582:186-195
[7]Dunnett SB,Ev eritt BJ,Robins TW.The basal fo re-br ain-co rtical cholinerg ic sy stem:Inte rpreting the functio n co nsequences of ex cito tox ic lesions.T rends in N euro scie nce, 1991,14:494-501
[8]Dunnett SB,W hishaw IQ,J o nes G H,et al.Behavio ral, biochemical and histo ch emical effects o f different neuro tox ic amino acids injected into nucleus basalis mag no cellularis of ra t. N eur oscience,1991,20:653-669
[9]Are ndt T,Ho lzer M,Fruth R,et a l.Paired helical fila-
—
17
—
ment-like pho sphor ylatio n o f Tau,Depositio n ofβ/A4-amy-loid and memo ry impairment in r at induced by chr onic inhibitio n o f phosphatase1A and2A.N euro science,1995,69:691-698
[10]Ba rtus R T,Dea n RL,Beer B,et a l.The cho liergic hy-po thesis o f g eristric memo ry dysfunctio n.Science,1982,217 (4558):408
[11]秦俊法.微量元素与脑功能,第1版.北京:原子能出版社,1994,52
[12]Kla tzo I,Wishiew ski H,Str eicher E,Experimental prduc tion o f neur ofibrilla ry deg ene ratio n.J N euro path Ex p N euro l,1965,24:187
[13]Car pper DG,Krishna n SS,Da kto n A J,Brain aluminum distribution in Alzeimer’s disease and ex perimenta l neuro fibril-la ry deg ene ration.Science,1973,180(4085):511
[14]李文彬,张炳烈,马向晨等.吡乙酰胺对三氯化铝中毒大白鼠回避反应受损的对抗作用.中国药理学与毒理学杂志, 1988,2(2):132
[15]Pe rl DP,Brody A R,Alzh eimer disease X-r ay spec-tr omet ric ev ience o f a luminum accumlatio n in neur ofibrilla ry tang lebearig n neuro ns.Science,1980,208(18):297
[16]刘成铮,陈光,途格晟等.Alzh eimer型老年性痴呆与铝的关系.临床神经病学杂志,1994,7(1):37
[17]胡海涛,钱亦华,杨杰等.淀粉样前体蛋白在痴呆模型大鼠背海马结构的表达,解剖学杂志,1997,20(5):444
[18]钱亦华,杨杰,任惠民等.痴呆模型大鼠背海结构内淀粉样蛋白沉积的免疫细胞化学研究,西安医科大学学报,1997, 18(30):304
[19]Bons N,M estre N,Ritchie K,et a1.Identifica tio n o f amy loid—be ta pro tein in the brain o f the smal1.Shor t liv ed lemuria n prima te micr ocebus murinus[J].N euro bio l Aging,1994,15(2):215-220
[20]ho b A,Nitta A,Na dai M,e t a1.Dysfunction of cholin-ergic and dopaminerg ic neuro na l sy stems in be ta—a myloid pr o-tein—infused ra ts[J].J N euro chem,1996,66(3):1113—1117
[21]徐如祥.阿尔茨海默病的分子机制与神经干细胞移植治疗[J].老年医学与保健,2004,10(3):177-180
[22]吴旋,徐海伟,黎海蒂等.AAN A T基因工程化ES细胞减少A PP高表达PC12细胞Aβ的分泌[J].第三军医大学学报,2003,25(3):209-211
[23]Quon D,Wa ng Y,Ca ta la no R,et al.Fo rma tio n o fβ-amyloid pr o tein depo sits in brains o f t ransg eoic mice.Na ture, 1991,352:239
[24]Ag e-r elated lear ning deficits in tr ansg enic mice ex-pr essing the751-amino acid isofo rm of humanβ-amy laid pre-cur so r pro tein.Pr oc.Na tl.Acad.Sci.U S A,1995,92:5341-5345
[25]Donald L P and Sang ram SS.Cellula r a nd molecular bi-o log y o f Alzh eimer’s disease a nd a nimal mo dels.Ann.Rev. M ed,1994,45:435-436
[26]PR ICE D L,T AN ZI R E,BO RCHEL T D R,et al. Alzheimer’s disease:genetic studies and t ransgenic models[J]. Annu Rev Genet,1998,32:461-493
[27]O DDO S,CA CC AM O A,SHEPHERD J D,e t al.T rip le2tra nsg enicmodel o f Alzheimer’s disea se with p la ques and tangles:int racellula r Abe ta and sy na p tic dy sfunctio n[J].Neu-ro n,2003,39(3):409-421
[28]BO RC HEL T D R,RA TO V I SK I T,V AN2L A RE J,et al.Acceler ated amyloid depositio n in the brains of tra ns-g enicmice coex p ressing muta nt pr esenilin1and amy loid p re-cur so r p r oteins[J].N euro n,1997,19(4):939-945
(上接第15页)设计的合理性,并且可以利用图形输出各个部件的位移、坐标、加速度、速度和力的变化情况,对运动机构进行优化。

学生按照本组的运动设计方案,必须独立计算尺寸参数。

在参数化建模过程中,学生通过给机构添加运动副,了解构件之间的连接关系。

包括:设置每个零件的连杆特性,设置两个连杆间的运动副和添加机构载荷;进行运动参数的设置,提交运动仿真模型数据,同时进行运动仿真动画的输出和运动过程的控制;运动分析结果的数据输出和表格、变化曲线输出,进行机构运动特性的分析。

通过这些训练,培养学生的综合能力和运用计算机辅助设计解决实际问题的能力,拓宽学生的知识面。

3.3教学效果
按照上述课程设计指导思想和教学改革内容,在机电工程系2005级10个班实施了机械原理课程设计教学。

全部学生都完成了课程设计规定的内容,取得了较好的教学效果。

(1)提供了创新空间和时间,调动了学生主动学习的热情。

部分学生提出了多种运动设计方案,虽然有些方案存在各种错误,但是切实开阔了学生的设计思路。

(2)课程设计过程大部分是要求独立完成的设计任务,避免了相互copy的现象。

同时设计过程中也有相互合作共同完成的内容,使个别基础较差的学生也能在课程设计中得到学习和训练。

(3)加深了对已学知识的理解,实现了学科之间的融会贯通。

经过机械原理课程设计的训练,使学生的综合能力明显提高,进一步加强了专业优势。

教学实践中也有很多不足之处需要在以后的教学实践中不断改进,例如:设计题目少,学生自由发挥的空间受到一定限制;实验条件暂时不足(机电工程实验楼在建设中),无法与实践环节相结合,缺乏对学生动手能力的培养;机械设计课程设计与机械原理课程设计分开进行,学生缺乏整机设计的理念等。

4.结束语
作为独立学院的机械类专业,在教学方法和内容上必须形成适合本专业的教学模式,做到因材施教。

这次“机械原理课程设计”的教学改革是探索适合独立院校机械类专业教学模式的有效尝试,为提高专业教学质量积累了经验。

参考文献
[1]裘建新.机械原理课程设计指导书.高等教育出版社[M].2005.
[2]胡小康.U G NX4运动分析培训教程.清华大学出版社[M].2006.
—
18—。