羟自由基清除率测定
抗氧化——精选推荐
抗氧化5 汉⿇叶多糖抗氧化活性测定⽅法5.1 羟基⾃由基的清除能⼒测定羟基⾃由基清除能⼒的测定⽅法采⽤颜军等⽅法并略有改动。
基本操作步骤为：先配置10 mg/mL 的样品溶液，在10 mL 的⽐⾊管中加⼊不同体积的被测溶液后，加⼊5 mol/L 的过氧化氢2 mL ，5 mmol/L FeSO 4 2mL 后，迅速加⼊5 mmol/L ⽔杨酸-⼄醇溶液2 mL 后⽤去离⼦⽔定容到10 mL ，放⼊37°C 的⽔浴锅中反应45 min 后，在波长510 nm 处，⽤紫外分光光度计测量各待测液的吸光度。
因为样品本⾝也具有⼀定的吸光度，如果忽略就会造成误差，所以⽤4 mL 去离⼦⽔代替FeSO 4和⽔杨酸-⼄醇溶液。
同时以2 mL 去离⼦⽔代替待测样品溶液，测定在没有抗氧化剂的条件下，⽔杨酸络合物的吸光度。
使⽤Vc 作为阳性对照按上述⽅法测定羟基⾃由基的清除率。
羟基⾃由基清除率公式为式(5-1)：100×+=0210A A A A -(%)清除率式(5-1) 式(5-1)中，A 0为空⽩对照液的吸光度，A 1为加⼊样品后的吸光度，A 2为不加过氧化氢的样品溶液的本底吸光度。
HLPs 、HLP-A 和HLP-B 对羟基⾃由基的清除能⼒测定结果如图3-20所⽰。
由图3-20可知，汉⿇叶多糖对羟基⾃由基具有较强的清除能⼒，且随着汉⿇叶多糖浓度的增加，其清除能⼒也逐渐增加，当多糖浓度达到1 mg/mL 时，HLPs 、HLP-A 和HLP-B 均达到最⼤值，分别为89.92%、81.51%和92.84%；HLPs 、HLP-A 和HLP-B 的IC 50值分别为0.449、0.563和0.331mg/mL ，说明HLP-B 的清除效果最好，清除能⼒强弱⽐较得：HLP-B>HLPs>HLP-A 。
图5-1 HLPs,HLP-A 和HLP-B 对羟基⾃由基的清除率5.2 DPPH ⾃由基清除能⼒测定DPPH ⾃由基清除能⼒测定⽅法采⽤Yao 等⽅法并略有改动。
Fenton反应产生的羟基自由基及其清除的分光光度法测定
改变 ＤＮＰＨ 的用量， 结果表明， 当 ＤＮＰＨ 的
用量大于 ０．５ｍＬ 时， 吸光度达到最大且基本稳
定。实验选择 ＤＮＰＨ 浓度为 １．５ｍｍｏｌ／Ｌ。
２．８ 方法的准确性与精密度
当没有清除剂存在时， 按实验方法， 对于
１．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＭＳＯ， ５ 次 测 定 的 吸 光 度 （ Ａ） 为 ：
ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｘ－ ｒａｙ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｉｎ ｔｒａｐｐｉｎｇ／ＥＰＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ［Ｊ］． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ ｂｉｏｍｅｄ， ２００４， ３６（９）：１１３４－ １１４３
２．５ ＤＭＳＯ 用量影响 ２
参考文献： ［１］ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｖ Ｌ． Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ［Ｊ］． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
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羟自由基清除能力测定原理
羟自由基清除能力测定原理一、引言羟自由基是一种高活性的化学物质，具有很强的清除能力。
羟自由基清除能力测定是一种常用的方法，用于评估化合物对自由基的抗氧化能力。
本文将介绍羟自由基清除能力测定的原理和相关实验方法。
二、羟自由基的产生羟自由基是一种带有羟基（OH）的自由基，具有很强的氧化能力。
羟自由基可以通过多种途径产生，例如光解水、氧化还原反应以及生物代谢过程中的产生等。
在实验室中，常用的产生羟自由基的方法是通过添加氢过氧化物和过氧化氢催化剂来进行。
三、羟自由基清除能力的评估方法1. 直接测定法直接测定法是最常用的羟自由基清除能力评估方法之一。
该方法利用特定的化学试剂（如5,5-二甲基-1-吡咯烷酮）与羟自由基发生反应，生成稳定的产物，通过测定产物的浓度变化来评估清除能力的强弱。
该方法操作简单、结果可靠。
2. 电子自旋共振法电子自旋共振法是一种基于电子自旋共振谱仪的测定方法。
该方法利用特定的探针与羟自由基反应生成稳定的产物，通过测定产物的电子自旋共振信号强度来评估清除能力的大小。
该方法对样品要求较高，需要配备专业的设备。
3. 化学计量法化学计量法是一种通过测定特定试剂的消耗量来评估羟自由基清除能力的方法。
该方法常用的试剂有抗坏血酸、谷胱甘肽等，通过与羟自由基反应生成稳定的产物，进而测定试剂的消耗量来评估清除能力的强弱。
该方法操作简单，适用于大批量样品的测定。
四、影响羟自由基清除能力的因素羟自由基清除能力受多种因素的影响，包括温度、pH值、浓度、反应时间等。
一般来说，较高的温度、适宜的pH值和较长的反应时间有助于提高羟自由基清除能力。
此外，样品的浓度也是影响清除能力的重要因素，适宜的浓度可以使清除能力得到准确的评估。
五、应用领域羟自由基清除能力测定在抗氧化剂的筛选和评估中具有广泛的应用。
抗氧化剂可以通过清除羟自由基来减轻氧化应激引起的损伤，具有重要的保护作用。
因此，羟自由基清除能力测定可以帮助筛选出具有较强抗氧化能力的化合物，并为新药开发和保健品研究提供依据。
银耳、木耳多糖清除羟自由基的比较实验
银耳、木耳多糖清除羟自由基的比较实验张磊;徐皓;孟超;殷晓蕾;黄超;李明明;宫晓婷【摘要】目的研究银耳多糖羟自由基的清除作用.方法采用酶解法提取银耳多糖粗品,蒽酮-硫酸比色法测定银耳多糖的含量,并稀释成三个浓度梯度,与过氧化氢-亚铁离子-水杨酸反应体系中的羟自由基进行反应以测定羟基清除率,以黑木耳为对照.结果银耳多糖清除羟自由基的效果随着浓度增加而增强:在浓度为0.5 mg/mL、1.5 mg/mL、3 mg/mL时其清除率分别为10.36％、18.04％、35.74％.结论银耳多糖与木耳多糖对羟自由基均有清除作用.3 mg/mL的银耳多糖对羟自由基清除率最高为35.74％,木耳多糖在同等浓度范围内为52％,银耳多糖的清除率小于同浓度下黑木耳多糖对自由基的清除率.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷),期】2019(040)007【总页数】4页(P493-496)【关键词】多糖;羟自由基;清除率【作者】张磊;徐皓;孟超;殷晓蕾;黄超;李明明;宫晓婷【作者单位】生命科学学院,山东第一医科大学(山东省医学科学院),山东泰安271016;生命科学学院,山东第一医科大学(山东省医学科学院),山东泰安 271016;生命科学学院,山东第一医科大学(山东省医学科学院),山东泰安 271016;生命科学学院,山东第一医科大学(山东省医学科学院),山东泰安 271016;生命科学学院,山东第一医科大学(山东省医学科学院),山东泰安 271016;生命科学学院,山东第一医科大学(山东省医学科学院),山东泰安 271016;生命科学学院,山东第一医科大学(山东省医学科学院),山东泰安 271016【正文语种】中文【中图分类】Q-331银耳(Tremella)又名白木耳、雪耳，属于隔担子菌亚门银耳科。
银耳在我国具有悠久的食用和药用历史，含有碳水化合物、蛋白质、维生素和多种氨基酸等。
目前研究最多的是银耳多糖。
银耳多糖(Tremella polysaccharides，TP)是重要的生物活性物质，可以通过激活免疫细胞来提高机体的免疫功能,使吞噬细胞吞噬能力提升，增加淋巴细胞活性从而提高其功能[1-3]，抗肿瘤[4]、预防肠道疾病[5-7]等功效。
分光光度法测定茶叶对羟基自由基的清除率
分光光度法测定茶叶对羟基自由基的清除率发布时间：2021-07-06T09:34:10.120Z 来源：《教育学》2021年5月总第249期作者：薛云尹俊泉[导读] 生物化和生物医学等领域中的重要研究课题。
与此同时，·OH测定方法的研究也备受关注。
甘肃省陇南市武都区莲湖小学746000摘要：邻二氮菲在紫外光区有强烈吸收，加入H2O2产生羟基自由基，茶叶提取液会使其中的羟基自由基减少，此时，溶液的吸光度值也随之减小，据此原理可以计算茶叶提取液对羟基自由基的清除率。
体系最佳实验条件为pH=7.00，缓冲溶液体积用量1.00mL，邻二氮菲浓度3×10-4mol/L，Fe2+浓度5×10-3mol/L，1%H2O2用量1.00mL，茶叶提取液用量20.00mL，按照邻二氮菲-Fe2+-H2O2顺序加入反应4min。
在以上实验条件下，测得羟基自由基的清除率为44.1%。
关键词：分光光度法邻二氮菲羟基自由基茶叶提取液机体的疾病与衰老是一个复杂的生物过程。
对此，学者们有各种解释，如自由基学说、传学说、交联学说、免疫学说等，其中自由基学说是目前国内外较普遍认同的一种。
自由基是一类外层轨道含有未配对电子的原子团或特殊状态分子，与人体关系最为密切的是氧自由基，如超氧自由基(·O2-)、羟基自由基(·OH)、脂自由基(ROO·)等，其中以·OH作用最强。
它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。
·OH还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关，羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标。
因此，·OH参与的各种研究已成为生物学、生物化和生物医学等领域中的重要研究课题。
与此同时，·OH测定方法的研究也备受关注。
近年来，国内外文献报道了检测羟自由基的主要方法有：电子自旋共振法、高效液相色谱法、化学发光法、光度法等。
抗氧化活性实验方法
抗氧化活性实验方法（体外实验）之巴公井开创作1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH 溶液。
分别取2mL分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。
取上清液于517nm处测吸光值。
用Vc作为阳性对照。
样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃ FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。
Vc作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。
EDTA为阳性对照。
样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe 2+()1201100%A A A -=-⨯螯合率 A 0—1mL 蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值； A 1—样品溶液反应后的吸光值；A 2FeCl 2溶液后的吸光值。
4、超氧自由基（O 2-）清除率的测定采取邻苯三酚自氧化法测定。
取50mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.2）4.5mL ，置25℃水浴中保温20min ，分别加入1mL 样品溶液和0.4mL 25mmol/L 邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min ，加入1mL 8mmol/L HCl 终止反应，于299nm 处测定吸光度（A x ），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。
分光光度法测定中药对羟自由基的清除率
!引言
机体的疾病与衰老是一个复杂的生物过程 . 对此学者们有各种解释，如自由基学说、遗传学说、交 联学说、免疫学说等，其中自由基学说是目前国内外较普遍认同的一种［1］. 自由基是一类外层轨道含有 未配对电子的原子团或特殊状态分子，与人体关系最为密切的是氧自由基，如超氧自由基（·O2 - ）、羟基 自由基（·OH）、脂自由基（ROO·）等，其中以·OH 作用最强 . 它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式 与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死 或突变 .·OH 还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关，羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的 重要指标 . 因此，·OH 参与的各种研究已成为生物学、生物化学和生物医学等领域中的重要研究课题 . 与此同时，·OH 测定方法的研究也倍受关注 .
（CV）、CV - Fe2 + 溶液、CV - Fe3 + 溶液、CV - H202 溶液的 最大吸收波长均在 588 nm 附近且吸光度值基本不变，而
CV - Fe2 + - H202 溶液的最大吸收波长也在 588 nm 附 近，但吸光度值较其它溶液体系下降（图 1），说明体系吸
光度值的下降是 Fenton 试剂产生的羟自由基与结晶紫 作用的结果 . 3 . 1 . 2 酸度的影响 测定 CV - Fe2 + - H202 体系在 pH 4 . 5 ~ 7 . 5 范围内不同酸度溶液的 !A，发现在 pH 为 5 . 5 时体 系 !A 有 最 大 值（ 图 2），故 选 择 体 系 的 酸 度 为
表 # 银杏叶水提取液和舒血宁药片清除羟自由基比较
羟自由基清除率测定方法
羟自由基清除率测定方法
1. 哎呀呀，你知道吗？有一种羟自由基清除率测定方法叫比色法呢！就好像我们通过眼睛看颜色的变化来判断一样，是不是很神奇？比如在做实验的时候，加入特定的试剂后，颜色一下子就变了，那就能知道羟自由基清除的情况啦！
2. 嘿，还有一种电子自旋共振法呢！这就好像是给羟自由基装上一个追踪器，能清楚地看到它们的动向和变化。
想象一下，在实验室里，我们能这么精准地捕捉到羟自由基的信号，是不是超厉害呀！就像警察抓小偷一样把它们都“逮住”呢！
3. 哇塞，化学发光法也是羟自由基清除率测定的好方法呀！这不就像夜晚的萤火虫一闪一闪地告诉我们它在哪里嘛！比如说当有物质能清除羟自由基时，那光芒就会减弱，多直观呀！
4. 哟呵！荧光分析法也很不错呢！它就像是一道光，照亮羟自由基的“踪迹”。
我们通过观察荧光的变化来了解羟自由基的清除效率，感觉自己就像个侦探一样在寻找线索呢！比如说在某个样品中加入特定试剂后，荧光发生了改变，那就是关键信息呀！
5. 哈哈，脉冲辐解法也能用来测羟自由基清除率哦！这就如同闪电划过，清楚地显示出羟自由基的状态呢。
就像闪电带来的瞬间光明一样，让我们能看清整个过程。
在实验中看到那些数据的变化，可有意思啦！
6. 哇哦！分光光度法也能担此大任呀！这就像用一个神奇的“眼睛”去观测羟自由基的世界。
我们按照步骤一步步操作，就能得到想要的结果啦。
比如说在特定波长下测量吸光度的变化，就知道羟自由基的清除情况如何啦！
我觉得这些羟自由基清除率测定方法都各有千秋，都为我们研究和了解羟自由基提供了有力的手段呀！。
几种常见食用菌清除羟基自由基能力的研究_马晓华
研究报 告
表 1 结果表明 , 食用菌粗多糖有显著的清除羟自 由基的能力 , 相当于每 100 m L 含 0.4 g 干品所得粗 多糖 的 清 除 羟 自 由 基 能 力 分 别 为 15.55 % 和 14.63 %。 但未经提取粗多糖的干菌浸提液本身的羟 自由基清除率远大于粗多糖溶液 。 说明在热水浸提 液中多糖具有一定的清除羟自由基能力 , 但由于粗多 糖溶液组成的复杂性 , 许多被沉淀下来的诸如蛋白质 等物质可能同样具有清除羟自由基能力 。 2.4 不同提取物清除羟基自由基能力的比较(图 3)
各取 8 g 由 1.2.2 制备的双孢蘑菇 、香菇和平菇 干菌粉 , 再将每种食用菌的 8 g 干菌粉等分为 4 份 , 2 g/ 份 , 各自分别加 20 m L 的双蒸水 、75 %乙醇 、无水 乙醇 、乙酸乙酯 , 充分搅拌 , 通风橱中各自密闭放置浸 提 14 h 后 , 过滤 , 各自取滤液即为不同提取溶剂的浸 提液 。 将浸提液放真空干燥箱中用真空泵抽取 12 h 后 , 在通风橱中自然挥发 5 d 至完全干燥得浸膏 。 分 别测定浸膏对羟自由基的清除能力 , 方法同 1.2.2 中 测定干菌粉对羟自由基清除能力的方法 。
物质活性的实验中检测其清除超氧阴离子自由基能 力的实验较多 , 研究表明 , 平菇多糖 、黑木耳多糖等具 有清除超氧自由基的作用[ 9～ 11] 。 羟自由基(·OH)是 最活泼的自由基 , 也是毒性最大的自由基 。它可以与 活细胞中任何分子发生反应造成损害 , 且反应速度极 快 , 被破坏的分子遍及糖类 、氨基酸 、磷脂 、核苷和有 机酸等[ 7] 。但几乎未见有人对食用菌清除羟自由基 能力进行研究 。 本文利用水杨酸法检测并比较研究 了几种常见食用菌鲜品及干品 的热水浸提液 、干菌 粉 、粗多糖 、冷水浸提液 、75 %乙醇浸提液 、无水乙醇 浸提液及乙酸乙酯浸提液的清除羟基自由基能力 , 初 步分析了几种食用菌清除羟基自由基物质的来源 。
羟自由基清除能力检测
羟自由基清除能力检测
羟自由基清除能力（Hydroxy free radical scavenging activity）是一种衡量物质抗氧化能力的重要指标。
目前有关羟自由基的分析测试方法主要有高效液相色谱法、化学发光法、荧光分析法、分光光度法等。
其中测定羟自由基清除能力最常用的是通过分光光度法测定样本抑制显色物邻二氮菲的吸光度的下降，从而反映样品清除羟自由基的能力。
测定原理为：
H2O2/Fe2+通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+ ，导致536nm吸光度下降，样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测羟自由基清除能力。
此外，我们还提供其他氧化应激类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定羟自由基清除能力样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 羟自由基清除能力信息。
羟基自由基清除能力的抗氧化能力评价 脱氧核糖法
羟基自由基（•OH）清除能力的评价：脱氧核糖法脱氧核糖法检测羟基自由基清除能力与溶剂影响【总流程图】脱氧核糖法评价（•OH）清除能力的总流程图图1 改进的脱氧核糖降解试验的操作过程[1]说明：脱氧核糖降解试验广泛用于评估羟基(•OH）食物或药物的自由基清除能力。
我们比较了在乙醇溶液中制备的25个抗氧化剂样品与去除乙醇（残留物）后制备的样品的羟自由基清除活性。
数据表明，乙醇溶液和残渣样品的测定结果相差约9倍。
这表明酒精的强烈干扰。
为了进一步研究其机理，用脱氧核糖法测定了18种有机溶剂（包括乙醇）的清除活性。
大多数纯有机溶剂（尤其是醇类）都能有效清除羟基自由基。
【实例】三种典型的抗氧化剂（含阿魏酸、槲皮素和褪黑素）的浓度响应曲线，在乙醇溶液和挥干乙醇后的对比。
这表明乙醇有严重干扰。
图2 阿魏酸的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）图3 槲皮素的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）图4 褪黑素（Melatonin）的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）【背景介绍及溶剂影响的原因分析】脱氧核糖降解试验自1987年建立以来，已广泛用于评估食品、营养素和药物的羟自由基清除能力。
在脱氧核糖降解试验中，通过芬顿反应获得•OH，随后，•OH攻击脱氧核糖并打破其环呋喃环，生成丙二醛（MDA）。
MDA与2-硫代巴比妥酸（TBA）结合，在530 nm处产生λmax的有色物质。
因此，A530nm值与生成的羟基自由基的量成正比，A530nm值越高，表明OH自由基水平越高。
如果添加抗氧化剂样品，A530nm值将降低，表明抗氧化剂清除了一些OH自由基。
这是脱氧核糖降解测定的原理。
与大多数生化分析一样，脱氧核糖分析需要在测量之前使用各种有机溶剂制备样品溶液。
然而，据观察，通常用于制备这些样品溶液的有机溶剂（尤其是醇类）可能会产生强烈干扰，而这些干扰往往被分析用户忽视。
几个研究小组明确表示，他们使用有机溶剂制备样品溶液，样品溶液直接用于脱氧核糖测定。
羟自由基清除能力测定试剂盒使用说明
羟自由基清除能力测定试剂盒使用说明 微量法
注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC1325 规格：100T/96S 产品内容：
标准液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 5mL×1 瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。 试剂三：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。 试剂四：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。
立即混匀，防止局部颜色过浓
样品（μL）
50
试剂四（μL）
20
20
H2O（μL）
70
50
混匀 37℃，60min，于微量石英比色皿/96 孔板中测定 536nm 处吸光值，空白管、对
照管和测定管的吸光值分别记为 A 空、A 对和 A 测。
注意：空白管和标准管只需测定一次。
计算公式： 羟自由基清除率 D% =（A 测-A 对）÷（A 空-A 对）×100%
2. 血清、果汁等液体样品可直接测定。
3. 提取物（或者药物）可配制成一定浓度，如 5 mg/mL。
二、 操作步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 536nm，蒸馏水调零。
2、 操作表
空白管
对照管
测定管
试剂一（μL）
30
30
30
试剂二（μL）
80
80
80
试剂三（mL）
20
20
20
A 空、A 对、A 测：空白管、对照管和测定管的吸光值。
注意事项： 为了比较不同样品羟自由基清除能力，对于同一批样品必须加入等量的样品，血清、组
织匀浆、果汁等液体样品加入同样体积，提取物（或者药物）配制成同样浓度。
·OH清除能力测量
羟基自由基(· OH)清除力的测定选用邻二氮菲法， 反应以 H2O2/Fe2+ 体系通过 Fenton 反应产生羟自由基，总反应可用下式表示： Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH。邻二氮菲-Fe2+水溶液被羟自由基氧化 为邻二氮菲-Fe3+后，其 536nm 最大吸收峰消失，根据以上原理，以 A536 变化反映羟自由基的氧化作用。配制蛋白质浓度为 0.1mg/mL 的 酶解液，具体测定方法如下： 样品管：取 1.2 mL 邻二氮菲溶液(5mmol/L)加入 0.8 mL 磷酸盐 缓冲液(0.2M,pH7.4)混匀后，加入 1.2 mL 样品溶液（0-25mg/ml）及 1.2mL EDTA(15mmol/L) ， 再 次 混 匀 ， 后 加 入 1.2 mLFeSO4 溶 液 (5mmol/L)，充分混匀后加入 1.6 mL H2O2(0.1%)，摇匀后于 37℃保温 1h，测 536nm 处吸光值 A536(样品)； 损伤管：以去离子水代替样品，其余步骤同样品管，所测吸光值 计为 A536(损伤)； 未损伤管：以去离子水代替 H2O2，其余步骤同损伤管，所测吸光 值计为 A536(未损伤)； 按照下式计算·OH 清除率： ·OH 清除率(%)＝(A536 样品－A536 损伤)×100%/(A536 未损伤－A536 损伤) GSH at 0–10 mg/ml was used as a control
1. You, L., et al., < i> In vitro</i> antioxidant activity and< i> in vivo</i> anti-fatigue effect of loach (< i> Misgurnus anguillicaudatus</i>) peptides prepared by papain digestion. Food Chemistry, 2011. 124(1): p. 188-194. 2. Zhu, L., et al., Reducing, radical scavenging, and chelation properties of in vitro digests of alcalase-treated zein hydrolysate. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008. 56(8): p. 2714-2721.
羟基自由基清除能力测定法的简易操作图解-脱氧核糖降解法-脱氧核糖分析法
羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解（适用于各种抗氧化剂）文献来源[1] XicanLi. Solven t effect s and improv ement s in the deoxyr ibose degrad ation assayfor hydrox ylradica l-scaven ging. Food Chemis try, 2013, 141(3):2082-2088.操作图解图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图具体方法1 溶液配制0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218gKH2PO4。
0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。
磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液p hosph ate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HP O4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。
Na2EDT A溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。
FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。
抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。
H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。
脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。
三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。
硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNa OH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据)。
抗氧化测定方法（三种）
实验一超氧阴离子自由基清除能力的测定——抗氧化实验之一一、目的要求通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。
二、实验原理超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。
邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。
三、器材及试剂（一）器材恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。
10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。
（二）试剂邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。
（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
（2）0.2mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制）四、操作步骤（一）样品的测定（1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比色管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入25℃水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。
羟自由基清除率测定
抗氧化活性的测定(参考)——测定活性物质对羟自由基的清除率（羟自由基清除试验）采用Fenton 试剂：过氧化氢/亚铁盐。
原理：H 2O 2与亚铁离子反应生成·OH,·OH 自由基一般存活时间比较短，具有较高的反应活性。
当在反应体系中添加水杨酸，便能快速的捕捉·OH 而产生紫色化合物（2,3-二羟基苯甲酸），该有色化合物在510nm 处有较大吸收峰，测其吸光度可表示羟自由基（•OH ）的多少，吸光度与羟自由基（•OH ）的量成正比。
反应体系中若加入羟自由基（•OH ）清除剂后，被氧化的水杨酸减少，则体系颜色变浅甚至消失，吸光度变小。
操作：样品处理：蔬菜水果切分，榨汁（切分后可放在2%的盐酸或草酸溶液中护色）。
将蔬菜汁或果汁放入50ml 离心管中（如有颜色加适量活性炭或白陶土），在3000~ 4000rpm 下离心10min~ 20min 后（若样品蛋白含量较高，需加适量乙酸锌，亚铁氰化钾）快速过滤，滤液备用。
取25ml 比色管2支（样品管、空白管），分别加入5ml 1mmol/L 硫酸亚铁溶液、5ml 3mmol/L H2O2溶液，样品管中加入1ml 样品溶液，空白管中加入1ml 蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L 水杨酸溶液定容至刻度，在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min 后，用分光光度计在510nm 的波长下测定各管的吸光度。
以3mmol/L 水杨酸溶液调零。
其对•OH 自由基的清除率SA （%），可根据下式进行计算：式中：A0—不加样品的吸光度； A1—加入样品的吸光度100A0A1-A0= SA(%)⨯清除率###【以往经验，不一定全适用】：若样品不进行脱色处理，则操作如下：在3支25ml 的比色管中（样品管、空白管、样品本底管）依次加入5ml1mmol/L 硫酸亚铁溶液，空白管和样品管中各加入5ml3mmol/L H 2O 2溶液，本底管中H 2O 2溶液用蒸馏水代替。
抗氧化活性实验方法
抗氧化活性实验方法（体外实验）1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。
分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。
取上清液于517nm处测吸光值。
用Vc作为阳性对照。
样品对DPPH 自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。
取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。
取上清液2.5mL，加入2.5mL 蒸馏水和0.5mL FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。
Vc作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。
EDTA为阳性对照。
样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe2+()121100%A AA-=-⨯螯合率A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；A1—样品溶液反应后的吸光值；A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。
4、超氧自由基（O2-）清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法测定。
取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度（A x），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。
清除自由基研究方法汇总
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。
目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。
其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。
而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。
分光光度法最常用。
原理部分：1.DPPH·法测试机理DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。
当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。
2. 羟基自由基（·OH）1）邻二氮菲法[70]实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。
H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。
如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。
根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。
2）水杨酸法[71]实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。
羟基自由基的清除 docx
西瓜汁清除羟基自由基的研究1前言羟自由基(·OH)是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易地氧化各种生物大分子，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的一种活性氧自由基，与机体的衰老、肿瘤发生发展、辐射损伤和细胞吞噬有关[1]。
离体检测·OH有多种方法，如电子自旋共振(ESR)法[2]、高效液相色谱(HPLC)法[2]、化学发光法[4]、比色法[5]和荧光法[6]等。
因甲基紫分光光度法测·OH所需设备简单，操作简便，试剂易得，测定快速，易为一般实验室所采用。
其基本原理是在最利于Fenton反应进行的pH下，溶液中的Fe( )主要以F(eOH)2形式存在，呈络合态的亚铁离子能够比游离状态的离子更快地催化过氧化氢产生·OH，这可能是由于络合中间体降低了铁离子表面电荷，减小了水化半径，有利于电子的传递，从而加快了反应速率。
甲基紫在pH妻3.10的酸性溶液中呈紫色，而·OH具有高反应活性，容易与甲基紫中具有高电子云密度的一C=C一基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色，故通过测定甲基紫吸光度值的变化可间接测定出·OH的生成量闭。
大量的研究指出摄食水果和蔬菜丰富的饮食与某类癌症和其它疾病发病率的降低相关联[8,9]，可能的解释是水果蔬菜中的微量营养素具有抗氧化活性，可清除活性氧自由基，抑制由之导致的疾病发生发展。
西瓜汁多味甜，是广受欢迎的世界性水果，在我国栽培面积也很大。
西瓜不但可消暑止渴，还有防治病之功效。
最近美国心脏协会授权在西瓜产品上可以使用有利于心脏健康的标志“Heart Heatlhy”。
在对西瓜进行的深加工中，以生产西瓜汁为最多，已有不少报道研制出多种西瓜汁产品，西瓜汁的医用价值在受到人们的极大关注。
目前对各种天然产物清除轻自由基的研究已有很多，尽管有报道在极干旱条件下，野生西瓜叶子中积累高浓度的轻自由基有效清除剂瓜氨酸与诱导的类型一2金属硫蛋白CLMT2[10,11]，而有医用功效的西瓜汁之清除经自由基作用还未见有文献报道，更没有不同瓤色西瓜汁清除轻自由基的研究。
抗氧化性检测(羟基自由基、普鲁士蓝)
d.还原能力的测定采用普鲁士兰法。
分别精密吸取各组分浓度为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mg/mL的多糖及Vc 溶液2mL，加入0.2mol/L pH=6．6的磷酸盐缓冲液2.5mL及1%铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，于50℃水浴加热20min后迅速冷却，再加入10%三氯乙酸溶液2.5mL，混匀后吸取2.5mL 溶液于比色管中，加蒸馏水2.5mL和0.1%氯化铁溶液0.5mL，常温反应10min后于700nm 处测定吸光值，吸光值越大，表明还原能力越强。
a.清除羟基自由基活性的测定采用水杨酸法。
在10mL试管中依次加入9mmol/LFeSO4溶液2mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL和各组分浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL的多糖或Vc溶液2mL，8.8mmol/LH2O2溶液2mL。
充分混匀后于37℃水浴30min，于510nm处测定吸光值A，以加蒸馏水为空白对照，做三次平行试验。
用以下公式计算对羟基自由基的清除率：R=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100%(2-10)式中，Ao表示加入蒸馏水空白体系的吸光值；Ai表示为加入不同浓度样品溶液后测得的吸光值。
Aj表示水代替H2O2时不同多糖浓度下测得的本底吸光值。
取7支试管依次加入1.8 mmol/L FeSO4 1.0mL、1.8mmol/L水杨酸0.75 mL、0.3% H2O2 0.5mL摇匀，分别向7支试管中加入10 mg﹒L-1多糖溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL，再补水至0.5mL，摇匀，37℃水浴30 min，以双蒸水为参比测其510nm处吸光度Ax。
空白实验：0.5 mL双蒸水取代多糖溶液，重复上述过程，测吸光度A0；对照实验：用0.5 mL双蒸水取代H2O2溶液，重复上述过程，测吸光度A s；用蒸馏水分别取代多糖溶液和H2O2溶液，重复上述过程，测吸光度A s0 。
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抗氧化活性的测定(参考)——测定活性物质对羟自由基的清除率
（羟自由基清除试验）
采用Fenton 试剂：过氧化氢/亚铁盐。
原理：H 2O 2与亚铁离子反应生成·OH,·OH 自由基一般存活时间比较短，具有较高的反应活性。
当在反应体系中添加水杨酸，便能快速的捕捉·OH 而产生紫色化合物（2,3-二羟基苯甲酸），该有色化合物在510nm 处有较大吸收峰，测其吸光度可表示羟自由基（•OH ）的多少，吸光度与羟自由基（•OH ）的量成正比。
反应体系中若加入羟自由基（•OH ）清除剂后，被氧化的水杨酸减少，则体系颜色变浅甚至消失，吸光度变小。
操作：
样品处理：蔬菜水果切分，榨汁（切分后可放在2%的盐酸或草酸溶液中护色）。
将蔬菜汁或果汁放入50ml 离心管中（如有颜色加适量活性炭或白陶
土），在3000~ 4000rpm 下离心10min~ 20min 后（若样品蛋白含量较高，需加适量乙酸锌，亚铁氰化钾）快速过滤，滤液备用。
取25ml 比色管2支（样品管、空白管），分别加入5ml 1mmol/L 硫酸亚铁溶液、5ml 3mmol/L H2O2溶液，样品管中加入1ml 样品溶液，空白管中加入1ml 蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L 水杨酸溶液定容至刻度，在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min 后，用分光光度计在510nm 的波长下测定各管的吸光度。
以3mmol/L 水杨酸溶液调零。
其对•OH 自由基的清除率SA （%），可根据下式进行计算：式中：
A0—不加样品的吸光度； A1—加入样品的吸光度
100A0A1-A0= SA(%)⨯清除率
###【以往经验，不一定全适用】：若样品不进行脱色处理，则操作如下：在3支25ml 的比色管中（样品管、空白管、样品本底管）依次加入5ml1mmol/L 硫酸亚铁溶液，空白管和样品管中各加入5ml3mmol/L H 2O 2溶液，本底管中H 2O 2溶液用蒸馏水代替。
本底管和样品管分别加入1ml样品溶液，空白管中加入1ml蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L水杨酸溶液定容至刻度。
在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min 后用分光光度计在510nm的波长下测定吸光度。
空白管为A0，样品管为A1，本底管为A2。
其对·OH自由基的清除率SA（%），可根据下式进行计算：
清除率SA(%) =｛[(A0—(A1- A2) ]/A0｝×100[10]
式中：A0—不加样品的吸光度
A1—加入样品的吸光度
A2—本底的吸光度。