流式细胞术应用与进展
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激光 488nm 488nm 荧光抗体 CD3-FITC CD4-PerCP 最大发射波长 519nm 675nm 检测器 527/32nm 670/20nm
561nm
561nm
CD25-TRITC
CD8-Texas Red
572nm
615nm
585/40nm
610/20nm
荧光素的激发、发射波长与检测图例
Biomedical Analysis Center
三、流式细胞仪基本结构
电子系统 液 流 系 统 光 学 系 统
Light detectors FL3 PerCP, Cy5
FL2 PE
FL1 FITC
SSC
计 算 机 系 统
laser
FSC
Biomedical Analysis Center
no expression CD3-FIFra Baidu bibliotekC CD3-FITC CD4-PerCP
质谱流式细胞术获得的细胞树状结构图
质谱流式细胞术 (Mass Cytometry)
优点：
☺ 理论上可检测单细胞的100种以上的分子 ☺ 无需繁琐的荧光补偿 ☺ 细胞群的解析更清晰、信息量更大
缺点：
☺ 细胞被破坏，不能进行细胞分选 ☺ 灵敏度没有某些荧光燃料高
Biomedical Analysis Center
分裂间期 分裂期(M)
Biomedical Analysis Center
细胞周期分析
流式细胞仪检测：
流式细胞仪检测图例
Biomedical Analysis Center
细胞周期分析
结果解读：
细胞周期流式检测结果
Biomedical Analysis Center
细胞周期分析 结果解读：
G0/G1期：63.08% G2/M期：8.83% S期：28.10%
四、流式分析常用荧光素
1. 有机小分子
FITC、Cy5、Cy7、Alexa Flour、DyLight、TexasRed
优点：
☺ 容易标记 ☺ 标记抗体很稳定 ☺ 非常一致的发射光谱
缺点：
☺ 较小的光谱偏移(50-100nm) ☺ 荧光容易淬灭
Biomedical Analysis Center
四、流式分析常用荧光素
Biomedical Analysis Center
质谱流式细胞术 (Mass Cytometry)
基本原理：
过渡元素
质谱流式细胞术 (Mass Cytometry)
基本原理：
Biomedical Analysis Center
质谱流式细胞术 (Mass Cytometry) 基本原理：
圆点：表达分子种类 相同的细胞 圆点大小：细胞数目 相邻圆点：表达分子 种类相近 颜色：分子表达强弱
Biomedical Analysis Center
流式多色分析 流式细胞仪检测：
设置欲分析检测的目的细胞门
Biomedical Analysis Center
流式多色分析 结果解读：
流式多色分析 注意事项：
1. 根据流式细胞仪选选择荧光抗体 激光器：488nm、635nm、355nm、561nm 2. 根据分子的表达情况选择荧光抗体
Biomedical Analysis Center
五、流式细胞术的参数与数据
相对细胞大小
（前向角散射光 – FSC）
相对细胞颗粒密度和内部复杂度
（侧向角散射光 – SSC）
染色细胞的相对荧光强度
（荧光-Fluoresent light）
Biomedical Analysis Center
Biomedical Analysis Center
PS
细胞凋亡分析（Annexin V/PI） 流式细胞仪检测：
设置欲分析检测的目的细胞门
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
结果解读：
细胞凋亡检测结果
Biomedical Analysis Center
Biomedical Analysis Center
侧向角散射光 -- SSC
Side scatter detector
Laser beam
High granularity particle
Side scatter detector
Laser beam
Low granularity particle
细胞凋亡分析（Annexin V/PI） 注意事项：
1. 设置必需的对照 阴性对照、Annexin V单染、PI单染
2. 洗涤细胞时应轻柔，减少对细胞的机械损伤
3. 根据细胞特性，选择合适的离心条件
4. 选择多种凋亡分析方法
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
七、流式细胞术的应用
1. 细胞周期分析（DNA倍体分析） (cell cycle)
2. 细胞凋亡分析
(cell apoptosis)
3. 流式多色分析
(multi-parameter experiment )
4. 流式细胞术研究进展
Biomedical Analysis Center
细胞周期分析
SSC is proportional to cell granularity or internal complexity
Biomedical Analysis Center
基于FSC和SSC的全血散点图
Biomedical Analysis Center
基于FSC和SSC的组织细胞散点图
Biomedical Analysis Center
PerCP≈APC-Cy7≈FITC <<PerCP-Cy5.5<PE< APC = PE-Cy5
弱表达：高荧光强度荧光素标记的抗体
3. 考虑荧光抗体间补偿的多少 4. 设置必需的对照 同型对照、各抗体单染
Biomedical Analysis Center
流式多色分析 局限性：可同时检测的分子种类有限
G2/G1为1.95
峰的变异系数 CV：3.38%
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析
细胞凋亡不同时期的特点
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
原理：
1. 细胞凋亡 磷脂酰丝氨酸 (PS)外翻 2. Annexin V 与PS高亲和力结合 3. PI无法进入正常活细胞 4. 坏死细胞/晚期凋亡细胞 细胞膜受损 annexin V、PI能进入
2. 荧光蛋白
PE、APC、PerCP
优点：
☺ 稳定性好 ☺ 荧光强度高 ☺ 一致的发射光谱 （不同供应商间差别大）
缺点：
☺ 分子量大 ☺ 标记较困难
HCAM表达检测
Biomedical Analysis Center
四、流式分析常用荧光素
3. 蛋白-小分子偶联物
PE-Cy5、PE-Cy7、APC-Cy7、PE-TxRD
八、文献阅读
Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum
Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, Amir el-AD, Krutzik PO, Finck R, Bruggner RV, Melamed R, Trejo A, Ornatsky OI, Balderas RS, Plevritis SK, Sachs K, Pe'er D, Tanner SD, Nolan GP.
Biomedical Analysis Center
六、流式细胞分选原理
流式细胞分选器示意图
六、流式细胞分选原理
1. 在鞘液的包裹和推动下，细 胞悬液中的细胞被排成单列， 以一定速度从喷口喷出。 2. 喷嘴射出的液柱被分割成一 连串液滴，每液滴含1个细胞。 3. 充电电路对选定细胞液滴充 以正、负不同电荷。 4. 带电液滴携带细胞通过静电 场而发生偏转，落入收集器。 流式细胞分选示意图
蛋白-小分子偶联物发射荧光原理
Biomedical Analysis Center
四、流式分析常用荧光素
4. 常用核酸染料
碘化丙啶 (PI) 嵌入到双链DNA和RNA碱基对中 对碱基无特异性选择 不能穿过正常细胞膜 DAPI 结合双链DNA小槽(AT碱基对) 特异性比PI高 可穿透正常细胞膜
PI和DAPI染细胞核
流式细胞术应用与进展
(Flow Cytometry, FCM)
贾正才 副教授 TEL: 68752345 E-mail: zcjia2000@yahoo.com.cn 生物医学分析测试中心
一、流式细胞术
Flow Cyto metry
in motion cell measure
对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌） 逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。
Science. 2011;332(6030):687-96.
Biomedical Analysis Center
Introduction
1. The outline of hematopoiesis is generally understood. 2. A comprehensive framework of its systemwide properties remains to be determined.
发射光谱交叠图例
Biomedical Analysis Center
流式细胞术研究进展 质谱流式细胞术 (Mass Cytometry) 基本原理：
1. 传统流式细胞术与原子质谱法相结合 2. 过渡元素的同位素标记抗体
3. 流式细胞仪产生单细胞液滴，原子质谱检测每 个细胞上同位素的数量、种类
4. 理论上可同时检测单细胞上/细胞内的100种以 上的分子
前向角散射光 -- FSC
Laser
FALS Sensor
♠ FSC信号收集方向与激光束相平行 ♠ FSC与被测细胞相对大小及表面积相关
Biomedical Analysis Center
前向角散射光 -- FSC
Laser beam
Large particle
Detector
Laser beam
荧光强度 (Fluoresence intensity)
♠ 荧光信号的强度: 细胞表面或细胞内物质浓度
Biomedical Analysis Center
染色细胞的相对荧光强度
流式细胞分析结果直方图
Biomedical Analysis Center
染色细胞的相对荧光强度
流式细胞分析结果散点图
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
未调补偿
调节补偿后
Biomedical Analysis Center
流式多色分析
应用：
检测同一细胞上和/或细胞内多种分子的表达
荧光抗体选择原则：
1. 根据目标分子情况，选择相应荧光抗体。
2. 不同荧光抗体上的荧光素不同。
3. 不同荧光素的最大发射波长相差越大越好。
1953年，Parker和Hutcheon描述一种全血细胞 计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；
Biomedical Analysis Center
二、流式细胞仪发明过程
1967年，Kamemtsky和Melamed提出细胞分选 方法； 1969年，Fulwyler及其同事们发明第一台荧光 检测细胞计； 1972年，Herzenberg改进细胞分选器，能够检 测出荧光抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。 1975年，Kochler和Milstein提出单克隆抗体技 术。
Small particle
FSC is proportional to relative size & cell-surface area
Biomedical Analysis Center
侧向角散射光 -- SSC
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
♠ SSC信号收集方向与激光束相垂直 (90°) ♠ SSC与被测细胞内部颗粒度和结构复杂度相关
研究对象: 单细胞悬液
外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、
培养细胞、细菌、藻类等。
Biomedical Analysis Center
二、流式细胞仪发明过程
1930年，Casperrsson和Thorell致力于细胞的 计数； 1940年，Coons用结合荧光素的抗体标记胞内 蛋白； 1953年，Taylor利用分层鞘流原理，成功设计 红细胞光学自动计数器；
阴性对照：
确定阴性细胞
和阳性细胞的 界线。
阴性对照结果图例
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
Annexin V/PI单染：
不同荧光素发射 光谱交叠，导致 假阳性产生。 调节补偿，避 免假阳性引起的 实验结果错误。 发射光谱交叠
Biomedical Analysis Center
561nm
561nm
CD25-TRITC
CD8-Texas Red
572nm
615nm
585/40nm
610/20nm
荧光素的激发、发射波长与检测图例
Biomedical Analysis Center
三、流式细胞仪基本结构
电子系统 液 流 系 统 光 学 系 统
Light detectors FL3 PerCP, Cy5
FL2 PE
FL1 FITC
SSC
计 算 机 系 统
laser
FSC
Biomedical Analysis Center
no expression CD3-FIFra Baidu bibliotekC CD3-FITC CD4-PerCP
质谱流式细胞术获得的细胞树状结构图
质谱流式细胞术 (Mass Cytometry)
优点：
☺ 理论上可检测单细胞的100种以上的分子 ☺ 无需繁琐的荧光补偿 ☺ 细胞群的解析更清晰、信息量更大
缺点：
☺ 细胞被破坏，不能进行细胞分选 ☺ 灵敏度没有某些荧光燃料高
Biomedical Analysis Center
分裂间期 分裂期(M)
Biomedical Analysis Center
细胞周期分析
流式细胞仪检测：
流式细胞仪检测图例
Biomedical Analysis Center
细胞周期分析
结果解读：
细胞周期流式检测结果
Biomedical Analysis Center
细胞周期分析 结果解读：
G0/G1期：63.08% G2/M期：8.83% S期：28.10%
四、流式分析常用荧光素
1. 有机小分子
FITC、Cy5、Cy7、Alexa Flour、DyLight、TexasRed
优点：
☺ 容易标记 ☺ 标记抗体很稳定 ☺ 非常一致的发射光谱
缺点：
☺ 较小的光谱偏移(50-100nm) ☺ 荧光容易淬灭
Biomedical Analysis Center
四、流式分析常用荧光素
Biomedical Analysis Center
质谱流式细胞术 (Mass Cytometry)
基本原理：
过渡元素
质谱流式细胞术 (Mass Cytometry)
基本原理：
Biomedical Analysis Center
质谱流式细胞术 (Mass Cytometry) 基本原理：
圆点：表达分子种类 相同的细胞 圆点大小：细胞数目 相邻圆点：表达分子 种类相近 颜色：分子表达强弱
Biomedical Analysis Center
流式多色分析 流式细胞仪检测：
设置欲分析检测的目的细胞门
Biomedical Analysis Center
流式多色分析 结果解读：
流式多色分析 注意事项：
1. 根据流式细胞仪选选择荧光抗体 激光器：488nm、635nm、355nm、561nm 2. 根据分子的表达情况选择荧光抗体
Biomedical Analysis Center
五、流式细胞术的参数与数据
相对细胞大小
（前向角散射光 – FSC）
相对细胞颗粒密度和内部复杂度
（侧向角散射光 – SSC）
染色细胞的相对荧光强度
（荧光-Fluoresent light）
Biomedical Analysis Center
Biomedical Analysis Center
PS
细胞凋亡分析（Annexin V/PI） 流式细胞仪检测：
设置欲分析检测的目的细胞门
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
结果解读：
细胞凋亡检测结果
Biomedical Analysis Center
Biomedical Analysis Center
侧向角散射光 -- SSC
Side scatter detector
Laser beam
High granularity particle
Side scatter detector
Laser beam
Low granularity particle
细胞凋亡分析（Annexin V/PI） 注意事项：
1. 设置必需的对照 阴性对照、Annexin V单染、PI单染
2. 洗涤细胞时应轻柔，减少对细胞的机械损伤
3. 根据细胞特性，选择合适的离心条件
4. 选择多种凋亡分析方法
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
七、流式细胞术的应用
1. 细胞周期分析（DNA倍体分析） (cell cycle)
2. 细胞凋亡分析
(cell apoptosis)
3. 流式多色分析
(multi-parameter experiment )
4. 流式细胞术研究进展
Biomedical Analysis Center
细胞周期分析
SSC is proportional to cell granularity or internal complexity
Biomedical Analysis Center
基于FSC和SSC的全血散点图
Biomedical Analysis Center
基于FSC和SSC的组织细胞散点图
Biomedical Analysis Center
PerCP≈APC-Cy7≈FITC <<PerCP-Cy5.5<PE< APC = PE-Cy5
弱表达：高荧光强度荧光素标记的抗体
3. 考虑荧光抗体间补偿的多少 4. 设置必需的对照 同型对照、各抗体单染
Biomedical Analysis Center
流式多色分析 局限性：可同时检测的分子种类有限
G2/G1为1.95
峰的变异系数 CV：3.38%
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析
细胞凋亡不同时期的特点
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
原理：
1. 细胞凋亡 磷脂酰丝氨酸 (PS)外翻 2. Annexin V 与PS高亲和力结合 3. PI无法进入正常活细胞 4. 坏死细胞/晚期凋亡细胞 细胞膜受损 annexin V、PI能进入
2. 荧光蛋白
PE、APC、PerCP
优点：
☺ 稳定性好 ☺ 荧光强度高 ☺ 一致的发射光谱 （不同供应商间差别大）
缺点：
☺ 分子量大 ☺ 标记较困难
HCAM表达检测
Biomedical Analysis Center
四、流式分析常用荧光素
3. 蛋白-小分子偶联物
PE-Cy5、PE-Cy7、APC-Cy7、PE-TxRD
八、文献阅读
Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum
Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, Amir el-AD, Krutzik PO, Finck R, Bruggner RV, Melamed R, Trejo A, Ornatsky OI, Balderas RS, Plevritis SK, Sachs K, Pe'er D, Tanner SD, Nolan GP.
Biomedical Analysis Center
六、流式细胞分选原理
流式细胞分选器示意图
六、流式细胞分选原理
1. 在鞘液的包裹和推动下，细 胞悬液中的细胞被排成单列， 以一定速度从喷口喷出。 2. 喷嘴射出的液柱被分割成一 连串液滴，每液滴含1个细胞。 3. 充电电路对选定细胞液滴充 以正、负不同电荷。 4. 带电液滴携带细胞通过静电 场而发生偏转，落入收集器。 流式细胞分选示意图
蛋白-小分子偶联物发射荧光原理
Biomedical Analysis Center
四、流式分析常用荧光素
4. 常用核酸染料
碘化丙啶 (PI) 嵌入到双链DNA和RNA碱基对中 对碱基无特异性选择 不能穿过正常细胞膜 DAPI 结合双链DNA小槽(AT碱基对) 特异性比PI高 可穿透正常细胞膜
PI和DAPI染细胞核
流式细胞术应用与进展
(Flow Cytometry, FCM)
贾正才 副教授 TEL: 68752345 E-mail: zcjia2000@yahoo.com.cn 生物医学分析测试中心
一、流式细胞术
Flow Cyto metry
in motion cell measure
对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌） 逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。
Science. 2011;332(6030):687-96.
Biomedical Analysis Center
Introduction
1. The outline of hematopoiesis is generally understood. 2. A comprehensive framework of its systemwide properties remains to be determined.
发射光谱交叠图例
Biomedical Analysis Center
流式细胞术研究进展 质谱流式细胞术 (Mass Cytometry) 基本原理：
1. 传统流式细胞术与原子质谱法相结合 2. 过渡元素的同位素标记抗体
3. 流式细胞仪产生单细胞液滴，原子质谱检测每 个细胞上同位素的数量、种类
4. 理论上可同时检测单细胞上/细胞内的100种以 上的分子
前向角散射光 -- FSC
Laser
FALS Sensor
♠ FSC信号收集方向与激光束相平行 ♠ FSC与被测细胞相对大小及表面积相关
Biomedical Analysis Center
前向角散射光 -- FSC
Laser beam
Large particle
Detector
Laser beam
荧光强度 (Fluoresence intensity)
♠ 荧光信号的强度: 细胞表面或细胞内物质浓度
Biomedical Analysis Center
染色细胞的相对荧光强度
流式细胞分析结果直方图
Biomedical Analysis Center
染色细胞的相对荧光强度
流式细胞分析结果散点图
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
未调补偿
调节补偿后
Biomedical Analysis Center
流式多色分析
应用：
检测同一细胞上和/或细胞内多种分子的表达
荧光抗体选择原则：
1. 根据目标分子情况，选择相应荧光抗体。
2. 不同荧光抗体上的荧光素不同。
3. 不同荧光素的最大发射波长相差越大越好。
1953年，Parker和Hutcheon描述一种全血细胞 计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；
Biomedical Analysis Center
二、流式细胞仪发明过程
1967年，Kamemtsky和Melamed提出细胞分选 方法； 1969年，Fulwyler及其同事们发明第一台荧光 检测细胞计； 1972年，Herzenberg改进细胞分选器，能够检 测出荧光抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。 1975年，Kochler和Milstein提出单克隆抗体技 术。
Small particle
FSC is proportional to relative size & cell-surface area
Biomedical Analysis Center
侧向角散射光 -- SSC
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
♠ SSC信号收集方向与激光束相垂直 (90°) ♠ SSC与被测细胞内部颗粒度和结构复杂度相关
研究对象: 单细胞悬液
外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、
培养细胞、细菌、藻类等。
Biomedical Analysis Center
二、流式细胞仪发明过程
1930年，Casperrsson和Thorell致力于细胞的 计数； 1940年，Coons用结合荧光素的抗体标记胞内 蛋白； 1953年，Taylor利用分层鞘流原理，成功设计 红细胞光学自动计数器；
阴性对照：
确定阴性细胞
和阳性细胞的 界线。
阴性对照结果图例
Biomedical Analysis Center
细胞凋亡分析（Annexin V/PI）
Annexin V/PI单染：
不同荧光素发射 光谱交叠，导致 假阳性产生。 调节补偿，避 免假阳性引起的 实验结果错误。 发射光谱交叠
Biomedical Analysis Center