《现代生物学技术》实验指导

《现代生物学技术》实验指导手册

适用专业：保护区15

北京林业大学生物科学与技术学院

实验课程要求

（１）实验课前，请仔细预习实验，提前准备好实验中的相关知识如实验原理、实验仪器试剂、实验流程，做到心中

有数，实验前检查预习情况。

（２）实验课上，遵守各实验室的具体规定，注意人身安全和仪器的安全使用，严格按任课老师和试验老师的指导进

行实验。

（３）实验课上请带写有北京林业大学实验报告纸（统一A4格式大小纸张），在实验过程中有间隙时间可以用于实

验报告的完成。

（４）需要使用显微镜的实验，请按照学号使用，并填写使用记录。用毕请擦拭干净，低倍物镜或者空镜头对准通光

孔，降下物台，关闭计算机，盖好防尘罩。

实验一培养基配制及灭菌

一、实验目的

1、学习诱导烟草叶片愈伤组织和植株再生培养基的配置方法

2、学习培养基高压灭菌法

二、实验原理

相对高的生长素浓度有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂浓度有利于不定芽的分化，生长素浓度与细胞分裂素浓度相当有利于愈伤组织的诱导。通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官化。

三、实验用具及药品

1、仪器与器械：超净工作台、高压灭菌锅、光照培养箱、烧杯、三角瓶、培养皿、镊子、剪刀。

2、材料与试剂：烟草叶片、NAA储液0.05 mg/mL、6-BA储液0.05 mg/mL、MS基本培养基粉末、肌醇、蔗糖、琼脂。

四、实验方法及步骤

1、取少量的蒸馏水加入烧杯中。

2、按母液顺序和规定量，用移液管取母液，依次放入烧杯中。

3、细胞分裂素6-BA和生长素NAA等根据具体而定。愈伤诱导培养基吸取6-BA 0.5mg 和NAA 0.5mg，放入烧杯中。不定芽诱导培养基吸取6-BA 1.0 mg 和NAA 0.1 mg，放入烧杯中。

4、称取肌醇0.1g 、蔗糖30g，放入烧杯中。

5、定容至1000 mL。

6、用1M的NaOH调pH至6.3后，倒入三角瓶中。

7、称取琼脂7g，放入三角瓶。

8、用封口膜包扎瓶口，放入高压灭菌锅中，在121℃下灭菌15min。

9、灭菌后的培养基倒入平皿中，parafilm封板。

五、思考题

1. 是否所有激素都可以直接高压灭菌？

2. 思考培养基的硬度会受到哪些因素影响？

实验二叶片愈伤诱导及叶片再生培养

一、实验目的

学习并掌握叶片愈伤组织与叶片再生的方法与基本操作技术；

分析生长素和细胞分裂素对烟草叶片离体培养的作用，了解植株组织在离体培养条件下脱分化和再分化的特点。

二、实验原理

叶片再生：器官外植体如茎、叶等，可以诱导不定芽,一种是叶片背面接触培养基表面。再生形成完整植株。此外,从器官外植体也可以诱导出愈伤组织，经愈伤组织再分化成植株。受伤的叶片在无菌条件以及生长调节物质的作用下具有再生的能力,叶片再生是常用的器官发生途径之一。

愈伤诱导：植物细胞全能性，通过脱分化，使植物器官形成愈伤组织。

三、实验用具及药品

超净工作台、镊子、剪刀、高温消毒器、电磁炉、试管、培养皿等。已准备好的培养基。烟草等的组培苗。

四、实验方法及步骤

1. 第一种方法为沿组培苗叶片的垂直叶脉方向平行剪切2-4刀，均刚好剪断主脉为止，注意不要剪断这个叶片。第二种方法将叶片剪成0.5cmX0.5cm的小块。

2. 将剪切过的叶片水平放入上次已经配好的叶片再生培养基与愈伤诱导培养基中。

3. 封好瓶(皿)口、作好标记、放入培养室中进行培养(可暗培养)、观察。

4. 准备下次实验烟草转基因实验用的预培养培养平板(MS+BA 1.0mg/L+NAA 0. 1mg/L＋0.6%琼脂＋3%糖)及选择培养培养基(MS+BA 1.0mg/L++NAA 0.

1mg/L＋300 mg/L Cef+100 mg/L Kan +0.6%琼脂＋3%糖)，高压灭菌后以备下次实验使用。

6. 准备下次实验用的空瓶、无菌水及无菌滤纸的灭菌。

五、思考题及作业

1.观察几周后叶片的变化情况，统计愈伤组织诱导率、不定芽诱导率。

2.叶片培养必经愈伤组织阶段吗?

实验三农杆菌介导的目的基因转化

一、实验目的

通过农杆菌介导等基因转化方法获得转基因烟草植株。

二、实验原理

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，整合型的根癌农杆菌Ti质粒是最常用的一种载体。在Ti质粒上有一段T区，T-DNA能从该质粒转移到敏感植物的核基因组中。T-DNA边界有25 bp正向序列可能接受某种酶识别切割，进而形成环状中间体。此外，Ti质粒上还有一个约50 bp的Virlence区，简称Vir区，约有十几个基因，Vir区不在T-DNA内，Vir基因产物是一种跨膜蛋白。可以接受植物信号的诱导而发生构象的改变，成为活性蛋白。其中VirA基因可能是决定Ti宿主范围的基因。根据Vir质粒的基本构造，通常认为由根癌农杆菌介导的外源DNA转移和转化要具备三个因素:1）位于农杆菌染色体上的Chra和Chrb基因，这两个基因细菌细胞对植物细胞的识别和吸附有关；2）T-DNA边界序列对于T-DNA整合到植物染色体的过程是必要的；3）Vir基因的活化可以启动DNA向植物细胞的转移。农杆菌介导的基因转移是双子叶植物中最为广泛而有效的遗传转化体系。

三、实验器具、材料和试剂

无菌烟草苗、根癌农杆菌EHA105、LBA4404或GV3101、含有目的基因的植物表达载体质粒、MS母液(大量元素、微量元素、铁盐、有机)、植物激素6-BA，NAA(0.1mg/m L)
、卡那霉素(50mg/m L)、头孢霉素(300mg/m L)、琼脂(5g/L)、白砂糖、限制性内切酶
、T4 DNA连接酶、凝胶DNA回收试剂盒、YEB培养基、无菌去离子水。

冰箱（-20°C、4°C）、离心机、摇床、水浴锅、培养皿、剪刀镊子、三角瓶、接种针、枪头、移液枪、滤纸等。