现代分析测试技术-光学显微技术
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阿贝成像原理真实地反应了光学显微镜的成像过程，但解释 放大不够直观。 显微镜可实现放大原因的理解：（直线传播作图解释）
15
2.3 光学显微镜的构造和光路图
16
2.3.1 光学系统
目镜、物镜、光源、 聚光器:集中光线，包括聚光镜和孔径光阑。
2.3.2 机械部分
机架：底座和弯臂 目镜筒 物镜转换器 载物台 调焦机构
第二章 光学显微技术
1
2.1 光学显微镜的发展历程 12世纪初，阿尔海真磨制透镜。 1590年， 詹森父子就制造出第一台放大倍数约为20
倍的显微镜。 1610年意大利物理学家伽利略制造了具有物镜、目
镜及镜筒的复式显微镜。 1611年开普勒阐明了显微镜的基本原理。 1625年，法布尔首先提出“显微镜”一词。 1628年前后舒纳在开普勒设计的基础上制造出近代
*****
20世纪中叶，人们采用短波长的光线作光源制造出 荧光显微镜和紫外光显微镜，由于光源波长的缩短 而提高了显微镜的分辨本领。
4
2.2 光学显微镜的成像原理
2.2.1 衍射的形成-光波相互之间的干涉作用
如果照明光线为平行光，在狭 缝中间连线上的每一点可以看作 是一个光源，发射子波，由于这 些子波相互之间的干涉作用，光 的能量分布变得不再均匀。
（遮蔽夫琅和费衍 射花样的一部分）
物像是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让 衍射光通过就不能成像，参与成像的衍射斑点越多， 则物像与物体的相似性越好。
14
由于衍射等因素的影响，显微镜的分辨能力和放大能力都受 到一定限制。目前金相显微镜可观察的最小尺寸是200 nm，有 效放大率最大为1500-1600倍。
衍射（散射）光干涉条件：
(2n 1),互相削弱 2
k,互相加强
11
样品 物镜 后焦面
像平面
埃利斑
平行衍射光束经透镜后会在物镜后 焦面上会聚，产生衍射花样--夫琅和 费衍射花样。
k=0，光程差为0，为直射光，聚焦 在主轴上，为0级衍射斑-焦点。
衍射斑点是由不同物点的散射光相 干加强形成的；从同一物点发出的散 射光，在产生相应的衍射斑点后继续 传播，在像平面上又相互干涉，形成 图像，这个图像就是物像。
埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜 nsinα值（数值孔 径） 成反比。
9
2.2.2 阿贝衍射成像原理 ➢当物质小至可与光波的波长相比较时，不能把光线 看成是直线传播，而要考虑衍射效应； ➢显微镜中的光线总是部分相干的，因此显微镜的成 像过程是个衍射相干过程。
10
德国物理学家阿贝最先用光的衍射 相干涉理论解释了透射光显微镜的成像 过程，与点光源衍射的区别在于成像的 过程包括很多点光源的干涉效应。
通常以埃利斑第一暗环的半径来衡量其大小。埃利斑约84%的 强度集中在中央亮斑，其余则分散在第一亮环、第二亮环……。 由于周围亮环光强度比较低，一般情况肉眼不易分辨，只能看到 中央亮斑。
8
点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径R0为
R0
0.61M n sin
n：透镜物方介质折射率； ：为照明光波长； ：为透射孔径半角； M：为透镜放大倍数
12
阿贝成像原理分为两次干涉过程：
1、平行光束遭到物的散射作用而 分裂成为各级衍射谱--由物变换到衍 射谱的过程；
2、各级衍射谱经过干涉重新在像 平面上会聚成像点--由衍射重新变换 到像(像是放大了的物)的过程。
13
物与像之间的相似性是由什么决定的呢？
(a)
(b)
(c)
(d)
最终图像：
遮蔽方法：
17
2.4 显微镜的重要光学技术参数
显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、 焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都 是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的。
18
2.4.1 数值孔径
0.61M R0 n sin NA n sin
数值孔径是物镜与被检物体之间介质的折射率和半孔径角
6
屏幕上的P2 点到狭缝上边缘的 距离和它到狭 缝下边缘的距离之 差为3/2波长。此点位于相干增强 中心，为第一级衍射放大值。
第二、第三和更高级的衍射极 大值发生在波程差为半波长的奇 数倍处，而相干极小值发生在波 程差为半波长的偶数倍处。
7
由于衍射效应，一个点光源在像平面上将形成一个具有一定 尺寸的中央亮斑及其周围明暗相间的圆环所组成的所谓埃利斑。
显微镜。 2
1665年，罗伯特胡克制造复式显微镜，140倍，观 察细胞。
1684年，荷兰物理学家惠更斯设计并制造出结构简 单的双透镜目镜-惠更斯目镜，是现代多种目镜的 原型。已初具现代显微镜的基本结构。
3
19世纪70年代， 德国的物理学家、数学家恩斯特阿 贝提出了完善的显微镜理论，阐明了成像原理、数 值孔径等问题，对显微镜发展的贡献最为卓著。
20
Baidu Nhomakorabea
样品的细节越微小（b的值越小）,P1会越远离P0，形成各级衍射 极大值所需要的衍射角越大，越需要更大口径的物镜去接收衍射 光线，过于细小的物体会形成超过物镜接收能力的一阶极大值衍 射光线，将无法成像。
21
折射率的影响
0.61M R0 n sin NA n sin
物镜接收衍射光线的能力也强烈地依赖于样品与镜头之间的 介质，如空气、水、玻璃和油等。
的正弦之乘积。
NA是表示物镜分辨细节能力的参数，是判断物镜性能高低
的重要标志。
α
物
孔径角越大，进入物镜的光通量就越大，分辨率就越高。
与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。
19
孔径角的影响
根据阿贝成像原理，衍射光线反映了物体形貌的细节，因此 一个物镜要反映物体的细节，必须能够接受尽量多的高阶衍射光 线。作为最低的要求，物镜必须能接收0级光和部分的一阶衍射 极大值光线，如果能够全部接收一阶衍射光线，图像基本上不会 失去细节。
显微镜观察时，若想增大NA 值，孔径角是无法增大的，唯一 的办法是增大介质的折射值。基于这一原理，就产生了水浸物 镜和油浸物镜率，因介质的折射率值大于1, NA值就能大于1。
5
叠加效果
屏 幕 上 的 P1 点 到 狭 缝 上 边 缘 的 距离和它到狭缝下边缘的距离之 差为一个波长。 连线b上发出其他任意两列光波到 达点的波程差均小于一个波长。
狭缝上缘处发出的一个子波， 和狭缝中央下方且紧邻着的点发 出的第二个子波，二者波程差为 半个波长，此时发生相干抵消。 造成P1 点位于光强的谷底。
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2.3 光学显微镜的构造和光路图
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2.3.1 光学系统
目镜、物镜、光源、 聚光器:集中光线，包括聚光镜和孔径光阑。
2.3.2 机械部分
机架：底座和弯臂 目镜筒 物镜转换器 载物台 调焦机构
第二章 光学显微技术
1
2.1 光学显微镜的发展历程 12世纪初，阿尔海真磨制透镜。 1590年， 詹森父子就制造出第一台放大倍数约为20
倍的显微镜。 1610年意大利物理学家伽利略制造了具有物镜、目
镜及镜筒的复式显微镜。 1611年开普勒阐明了显微镜的基本原理。 1625年，法布尔首先提出“显微镜”一词。 1628年前后舒纳在开普勒设计的基础上制造出近代
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20世纪中叶，人们采用短波长的光线作光源制造出 荧光显微镜和紫外光显微镜，由于光源波长的缩短 而提高了显微镜的分辨本领。
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2.2 光学显微镜的成像原理
2.2.1 衍射的形成-光波相互之间的干涉作用
如果照明光线为平行光，在狭 缝中间连线上的每一点可以看作 是一个光源，发射子波，由于这 些子波相互之间的干涉作用，光 的能量分布变得不再均匀。
（遮蔽夫琅和费衍 射花样的一部分）
物像是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让 衍射光通过就不能成像，参与成像的衍射斑点越多， 则物像与物体的相似性越好。
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由于衍射等因素的影响，显微镜的分辨能力和放大能力都受 到一定限制。目前金相显微镜可观察的最小尺寸是200 nm，有 效放大率最大为1500-1600倍。
衍射（散射）光干涉条件：
(2n 1),互相削弱 2
k,互相加强
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样品 物镜 后焦面
像平面
埃利斑
平行衍射光束经透镜后会在物镜后 焦面上会聚，产生衍射花样--夫琅和 费衍射花样。
k=0，光程差为0，为直射光，聚焦 在主轴上，为0级衍射斑-焦点。
衍射斑点是由不同物点的散射光相 干加强形成的；从同一物点发出的散 射光，在产生相应的衍射斑点后继续 传播，在像平面上又相互干涉，形成 图像，这个图像就是物像。
埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜 nsinα值（数值孔 径） 成反比。
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2.2.2 阿贝衍射成像原理 ➢当物质小至可与光波的波长相比较时，不能把光线 看成是直线传播，而要考虑衍射效应； ➢显微镜中的光线总是部分相干的，因此显微镜的成 像过程是个衍射相干过程。
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德国物理学家阿贝最先用光的衍射 相干涉理论解释了透射光显微镜的成像 过程，与点光源衍射的区别在于成像的 过程包括很多点光源的干涉效应。
通常以埃利斑第一暗环的半径来衡量其大小。埃利斑约84%的 强度集中在中央亮斑，其余则分散在第一亮环、第二亮环……。 由于周围亮环光强度比较低，一般情况肉眼不易分辨，只能看到 中央亮斑。
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点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径R0为
R0
0.61M n sin
n：透镜物方介质折射率； ：为照明光波长； ：为透射孔径半角； M：为透镜放大倍数
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阿贝成像原理分为两次干涉过程：
1、平行光束遭到物的散射作用而 分裂成为各级衍射谱--由物变换到衍 射谱的过程；
2、各级衍射谱经过干涉重新在像 平面上会聚成像点--由衍射重新变换 到像(像是放大了的物)的过程。
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物与像之间的相似性是由什么决定的呢？
(a)
(b)
(c)
(d)
最终图像：
遮蔽方法：
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2.4 显微镜的重要光学技术参数
显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、 焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都 是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的。
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2.4.1 数值孔径
0.61M R0 n sin NA n sin
数值孔径是物镜与被检物体之间介质的折射率和半孔径角
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屏幕上的P2 点到狭缝上边缘的 距离和它到狭 缝下边缘的距离之 差为3/2波长。此点位于相干增强 中心，为第一级衍射放大值。
第二、第三和更高级的衍射极 大值发生在波程差为半波长的奇 数倍处，而相干极小值发生在波 程差为半波长的偶数倍处。
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由于衍射效应，一个点光源在像平面上将形成一个具有一定 尺寸的中央亮斑及其周围明暗相间的圆环所组成的所谓埃利斑。
显微镜。 2
1665年，罗伯特胡克制造复式显微镜，140倍，观 察细胞。
1684年，荷兰物理学家惠更斯设计并制造出结构简 单的双透镜目镜-惠更斯目镜，是现代多种目镜的 原型。已初具现代显微镜的基本结构。
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19世纪70年代， 德国的物理学家、数学家恩斯特阿 贝提出了完善的显微镜理论，阐明了成像原理、数 值孔径等问题，对显微镜发展的贡献最为卓著。
20
Baidu Nhomakorabea
样品的细节越微小（b的值越小）,P1会越远离P0，形成各级衍射 极大值所需要的衍射角越大，越需要更大口径的物镜去接收衍射 光线，过于细小的物体会形成超过物镜接收能力的一阶极大值衍 射光线，将无法成像。
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折射率的影响
0.61M R0 n sin NA n sin
物镜接收衍射光线的能力也强烈地依赖于样品与镜头之间的 介质，如空气、水、玻璃和油等。
的正弦之乘积。
NA是表示物镜分辨细节能力的参数，是判断物镜性能高低
的重要标志。
α
物
孔径角越大，进入物镜的光通量就越大，分辨率就越高。
与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。
19
孔径角的影响
根据阿贝成像原理，衍射光线反映了物体形貌的细节，因此 一个物镜要反映物体的细节，必须能够接受尽量多的高阶衍射光 线。作为最低的要求，物镜必须能接收0级光和部分的一阶衍射 极大值光线，如果能够全部接收一阶衍射光线，图像基本上不会 失去细节。
显微镜观察时，若想增大NA 值，孔径角是无法增大的，唯一 的办法是增大介质的折射值。基于这一原理，就产生了水浸物 镜和油浸物镜率，因介质的折射率值大于1, NA值就能大于1。
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叠加效果
屏 幕 上 的 P1 点 到 狭 缝 上 边 缘 的 距离和它到狭缝下边缘的距离之 差为一个波长。 连线b上发出其他任意两列光波到 达点的波程差均小于一个波长。
狭缝上缘处发出的一个子波， 和狭缝中央下方且紧邻着的点发 出的第二个子波，二者波程差为 半个波长，此时发生相干抵消。 造成P1 点位于光强的谷底。