超滤法研究羌活提取物中异欧前胡素与人血清白蛋白的结合作用_龙怀聪

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China Pharmaceuticals

2012年9月5日第21卷第17期Vol．21，No．17，September 5，2012

羌活为伞形科植物羌活、宽叶羌活或川羌活的根茎及茎，具有散寒、

祛风湿、止痛等功效，是中、藏、羌医药体系中的常用药材，临床主要用于感冒风湿、发热头痛、肩背酸痛、痈疽疮毒等疾病。羌活成分复杂，有大量文献对其化学成分进行鉴定研究，主要为香豆精类化合物、挥发油、酚性化合物和氨基酸等[1－4]。2010年版《中国药典(一部)》将异欧前胡素的含量作为羌活质量控制的指标[5]。

笔者采用超滤法和高效液相色谱－荧光检测法对羌活提取物中异欧前胡素与人血清白蛋白(HSA )的结合特性进行了研究，为羌活以及异欧前胡素的药理学研究和临床应用提供参考。1

仪器与试药

岛津2010C 型高效液相色谱仪，RF －10A 荧光检测器；LC －solution 色谱工作站；WH －1型旋涡混合器；赛多利斯BS224S 型电子天平；超滤离心管(Millipore ，MWCO:3000)；TGL －16型离心机(上海医用仪器厂)。羌活提取物（西安艾美特生物有限公司）；异欧前胡素对照品（上海劲马生物科技有限公司，批号为110827－200807）；人血清白蛋白（HSA ，250mg ，sigma 公司）；乙腈（色谱纯，fisher 公司）；蒸馏水自制，其他试剂分析纯。2方法与结果2．1含量测定2．1．1

色谱条件

色谱柱：Kromasil C 18柱（200mm ˑ4．6mm ，5μm ）；激发波长：310nm ；发射波长：480nm ；流动相：乙腈－20mmol /mL 磷酸溶液(55ʒ45)；流速:1．0mL /min ；柱温：40ħ；进样量：20μL 。2．1．2溶液制备

取羌活提取物0．1g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入无水乙醇50mL ，超声处理30min ，放冷，过滤，将续滤液减压浓缩至

干，用磷酸盐缓冲溶液（20mmol /L ，pH =7．4，

内含0．15mol /L 氯化钠）50mL 定容，

作为供试品贮备液。取贮备液适量用流动相稀释5倍，照2．1项下方法按外标法测定异欧前胡素的含量，贮备液中异欧前胡素的浓度为2．96ˑ10－4mol /L ，临用时用缓冲溶液

稀释。

精密称取HSA 适量，用pH =7．4的磷酸盐缓冲溶液溶解制成浓度为2．0ˑ10－4mol /L 的HSA 溶液，置4ħ冰箱中备用。2．1．3方法学考察

专属性考察：超滤液、对照品、超滤液+供试品的色谱图见图1。异欧前胡素的保留时间约为14．1min ，其他杂质不干扰样品的分离测定。

线性关系考察：精密吸取贮备液适量，用pH =7．4的磷酸盐缓冲溶液溶解制成系列浓度工作液（1．2，4．5，9．2，18．5，37，74，148μmol /L ），照2．1项下方法吸取20μL 注入色谱仪，记录色谱图。以峰面积比A 为纵坐标、浓度C 为横坐标进行线性回归，得标准曲线方程A =22108+8533147C ，r =0．9996(n =7)。结果表明，在2．25 148μmol /L 范围内，异欧前胡素的峰面积与浓度线性关系良好，定量限为1μmol /L 。

精密度和回收率试验：精密吸取贮备液适量，用pH =7．

4的

1.异欧前胡素

A.空白超滤液

B.异欧前胡素对照品

C.异欧前胡素超滤液图1高效液相色谱图

超滤法研究羌活提取物中异欧前胡素与人血清白蛋白的结合作用

龙怀聪1，龙恩武1，袁浩宇2

（1.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川成都

610072；

2.核工业四一六医院，

四川成都610051）

摘要：目的采用超滤法研究羌活提取物中异欧前胡素与人血清白蛋白（HSA ）的结合作用。方法采用超滤法和高效液相色谱－荧光法测定游离异欧前胡素的质量浓度，计算蛋白结合率，并根据Scatchard 作图法计算结合常数。结果当质量浓度为3．2，6．4，13．6，

27．7，57．1μmol /L 时，异欧前胡素平均HSA 结合率分别为56．2%，54．9%，54．4%，49．7%，44．1%。结合常数为2．12ˑ104L /mol ，结合位点数n 为0．4。

结论所用法简单、快速，适合于异欧前胡素蛋白结合率研究。异欧前胡素与人血浆白蛋白具有中等强度的结合。关键词：异欧前胡素；血浆蛋白结合率；配体垂钓法；超滤法；高效液相色谱法

中图分类号：R285．5；R284．1

文献标识码：A

文章编号：1006－4931(2012)17－0011－03

Study on Affinity of Isoimperatorin in Notopterygium Extract to Human Serum

Albumin by Ultrafiltration Method

Long Huaicong 1，Long Enwu 1，Yuan Haoyu 2

(1．Sichuan Academy of Medical Sciences，Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu，Sichuan，China

610072;

2．416Hospital of Nuclear Industry Ministry，Chengdu，Sichuan，China

610051)

Abstract:Objective To study the affinity of isoimperatorin extracted from notopterygium to human serum albumin (HSA )by ultrafiltra-tion method．Methods

The ultrafiltration method combined with the HPLC －fluorescence method was employed to determine the con-centration of free isoimperatorini and calculate the protein binding rate of isoimperatorin and the binding constant according to the Scatchard plot．Results

In the plasma concentrations of 3．2，6．4，13．6，27．7，57．1μmol /L，the average HSA binding rates of isoimper-atorin were 56．2%，54．9%，54．4%，49．7%and 44．1%respectively．The binding constant was 2．12ˑ104L /mol，and the numbers of binding site was 0．4．Conclusion

The used method is simple，rapid and suitable for the study of protein binding rate of isoimpera-

torin．Isoimperatorin possesses the moderate －intensity affinity with HSA．

Key words:isoimperatorin;plasma protein binding rate;ligand fishing method;ultrafiltration;HPLC

t /min

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·药物研究·Drug Research