细胞凋亡及检测方法

细胞凋亡细胞凋亡是指由基因所决定的细胞自动结束生命的过程，由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以也常常称为细胞编程性死亡（programmed cell death,PCD）。

具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需的细胞或即将发生特化的细胞。

例如，蛙的个体发育过程中，四肢的形成过程中尾巴消失等现象，都涉及细胞的自动死亡。

在形态学上把细胞凋亡分为三个阶段：第一个阶段是凋亡的开始，此阶段只是进行数分钟，细胞中所表现的特征是：微绒毛消失，细胞间接触消失，但是质膜保持完整性，线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并与质膜发生融合，染色质固缩等等；第二阶段是形成凋亡小体，核染色质发生断裂，形成许多的片段，与一些细胞器聚集在一起，然后被细胞质膜包围，形成凋亡小体；第三阶段是凋亡小体被吞噬细胞所吞噬，而其残留物质被消化后重新使用。

细胞凋亡是一个主动性自杀过程，所以它是一个耗能的过程，需要ATP提供能量。

【细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。

人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡（apoptosis）。

细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。

它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。

细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。

凋亡是多基因严格控制的过程。

这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。

而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。

如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程在不同的情况下，细胞凋亡的信号转导途径是有差别的，根据对caspase家族（半胱氨酸蛋白酶，它们的活性位点均包括半胱氨酸残基，能够特异的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，目前已有１３种caspase成员被先后发现或克隆，其中６种caspase与细胞凋亡有关）的依赖性可分为两大类型。

一类称为外在途径，由细胞表面的死亡受体，如Ｆａｓ和肿瘤坏死因子受体家族（ＴＮＦ－Ｒ）引发，死亡受体与配体结合后，通过跨膜信号转导把死亡信号转导入细胞内死亡域，进而引起caspase联级反应；另一类称为内在途径或线粒体途径，由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所表１细胞凋亡和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或外界因素的巨变如高温、强压等范围单个分散的细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体破损，通透性增加染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化，保持完整肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬基因组ＤＮＡ有控降解，等量断裂随机降解，无规则降解蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无，不放细胞内容物有，释放内容物，有明显的炎症反应。

发生基因突变，也没有发生基因重组和染色体变异。

细胞凋亡与细胞坏死的联系在某些细胞中，蛋白激酶RIP3的表达量是控制细胞凋亡或细胞坏死的关键。

如果RIP3表达量高细胞走向坏死路径；RIP3表达量低细胞则走向凋亡路径。

凋亡是一种自然死亡，是一种正常的生理现象，凋物中扩增到目的基因，而非转基因生物中则扩增不出目的基因。

PCR具有高度特异性和灵敏度，已成为转基因检测的核心技术并得到广泛应用，可用于定性或定量分析。

定性ＰＣＲ主要有标准PCR、巢式和半巢式PCR、多重PCR等，定量PCR主要有竞争定量PCR、实时荧光定量PCR、PCR－ELISA等。

早在1986年，Sen和他的同事们通过试验在B淋巴细胞的核提取物中发现了一种能与免疫球蛋白κ轻链基因特异结合的蛋白因子，并将其命名为核因子κB（Nuclear factor Kappa B，NF-κB）。

NF-κB广泛存在于多种细胞中，当细胞受到外部刺激（药物、辐射、缺氧等）或者细胞因子、病毒感染、脂多糖等刺激时，NF-κB 被激活并与相应的病毒、细胞因子、受体蛋白等所调节的基因增强子区结合，启动基因转录。

随着时间的推移，研究逐渐证明NF-κB是一种细胞核内极为重要的转录调节因子，对于细胞的增殖和分化、衰老和死亡、黏附和迁移都具有重要的调节作用。

NF-κB是由NF-κB/Rel蛋白家族成员NF-κB1（p50/前体为P105）、NF-κB2（p52/前体为P100）、Rel（p65）、RelB和C-Rel以同源或异源二聚体的形式组成。

虽然有多个不同的二聚体组合，但p50和 p65 组成的二聚体最早被发现，并且其分布和作用也最为广泛，是通常所说的NF-κB。

在细胞静息状态下，NF-κB以无活性状态存在于细胞浆中，并与抑制因子IκBs（包括IκBα、IκBβ，IκBγ、IκBε、IκBζ、IκBS和Bcl-3等）一起组成了异源多聚体P50/P60/IκBs。

在这个多聚体中，IκBs能阻碍 P50 和P65的二聚体化，使NF-κB以无活性的形式存在。

当细胞受到肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα，TNFα）、白介素或者其他药物的刺激时，IκBs的激酶IκK会被磷酸化激活，并作用于P50/P60/IκBs三聚体中的IκBs，使其从三聚体中脱离并被泛素化降解，暴露出P50亚基上的移位信号和P65亚基上的DNA结合位点，从而使P50/P65二聚体表现出NF-κB活性，并从细胞浆移位到细胞核中，然后与靶基因的κB基序结合，发挥转录调控作用。

除了上述的典型激活方式，NF-κB的激活还存在其他非典型的方式。

在非经典激活途径中，P100和RelB的二聚体被激活，这种激活主要存在于B细胞和T细胞发育过程中。

接收到特定的受体信号后（例如淋巴毒素B和B细胞活化因子）在NF-κB诱导激酶（NIK）的作用下，IκKa复合体被磷酸化进而引起p100的磷酸化，经蛋白激酶作用诱导产生p52-RelB异源二聚体，并使其进入细胞核参与核转录活动。

NF-κB对细胞凋亡的调控作用细胞凋亡是多细胞生物一种正常的生命现象，在受到外部或者内部的刺激以后，细胞为了维护内环境的稳态，出现由多种基因控制的细胞程序性的主动死亡。

细胞凋亡对于维持细胞正常生长和代谢稳定具有十分重要的意义，而细胞凋亡的异常与各种肿瘤的产生密切相关】细胞凋亡检测方法一、细胞凋亡的形态学检测1、光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2）染色细胞：姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。

苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。

2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。

三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。

Hoechst33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。

PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。

但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。

正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst 着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

3、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。

磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。

体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。

Annexin-V（green）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期坏死细胞可能为阴性），是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。