高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
应用高分辨熔解曲线分析技术检测β-地中海贫血基因突变
ｔ ｈ ａ ｌ ａ ｓ ｓ ｅ ｍｉ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔｈ ｅ ＨＲＭ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｆ ｉ ｖ ｅ ｋ ｉ ｎ ｄ ｓ ｏ ｆ ｃ ｏ ｍｍｏ ｎ ８ 一 ｔ ｈ ａ ｌ ａ ｓ ｓ ｅ ｍｉ ａ ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ（ 一 ２ ８，
王晶晶， 许朝旭， 彭 红 波
（ 广 州 市 番 禺 区 何 贤 纪 念 医 院检 验 科 ， 广 东广 州 ５ １ １ ４ ０ ０ ）
摘 要 ： 目的 探 讨 高 分辨 熔解 曲线 （ ＨＲＭ） 分析 技 术检 测 Ｂ 一 地 中海 贫 血 基 因突 变 的 可 行 性 。 方 法 应 用 ＨＲ Ｍ 法检 测广 东
Ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈ ｉ ｇ ｈ ｒ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｑ ｕ ｅ ｉ ｎ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ＿ ｔ ｈ ａ ｌ ａ ｓ ｓ ｅ ｍｉ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ
ＨＲ Ｍ 法能 准确 检 测 广 东省 ５种 常见 的 ０ 一 地 中海 贫 血 突 变 ， 具有简
便、 快速 、 灵敏度高等优点 ， 有 望 成 为 临床 筛查 Ｂ 一 地 中海 贫 血 突 变 的 新 方 法 。 关键词 ： Ｂ 一 地 中海 贫 血 ； 基 因突变； 高 分 辨 溶 解 曲 线
高分辨率溶解曲线分析
高分辨率溶解曲线分析概述高分辨率溶解曲线分析是一种广泛应用于生物学领域的分析技术，特别适用于检测基因表达、基因多态性、SNP位点以及DNA结构等。
该技术通过对双链DNA在不同温度下的解离曲线进行测定和分析，可以用来定量评估样品中特定序列的数量和质量。
原理高分辨率溶解曲线分析的原理基于PCR扩增反应后的DNA解离动力学。
在PCR扩增过程中，双链DNA会在高温下解开成两条单链DNA。
随后，在降温过程中，两条单链DNA会重新结合形成双链DNA。
在这个过程中，如果样品中存在特定的序列差异（如基因多态性或SNP位点），它们的解离和结合过程会发生略微的差异，这些差异可以通过溶解曲线分析来检测和分析。
溶解曲线分析一般通过添加DNA染料（如SYBR Green）来实现，该染料可与DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应后，样品中的DNA会逐渐增加，溶解荧光信号也会随之增强。
在降温过程中，不同的PCR产物的解离过程会导致荧光信号发生变化。
通过监测溶解曲线上的荧光信号强度，可以得到不同PCR产物的解离温度，进而从中推断样品中的目标序列的数量和质量。
实验步骤高分辨率溶解曲线分析通常包含以下几个步骤：1.PCR扩增反应：根据需要扩增的目标序列设计引物，并进行PCR扩增反应。
PCR反应体系中添加SYBR Green或其他DNA染料。
2.热变性：PCR扩增反应后，将样品在高温下进行变性，通常为95°C。
3.降温：将样品温度降低到特定的温度范围，通常为60-95°C，并持续监测荧光信号的强度。
4.溶解曲线分析：根据荧光信号强度和温度的变化关系，绘制溶解曲线图。
通过比较样品中特定序列的解离温度，可以评估目标序列的数量和质量。
5.数据分析：根据溶解曲线图，可以使用特定的软件或算法对数据进行定量分析。
常见的分析方法包括计算解离温度、判断PCR产物的品质以及定量评估样品中的目标序列含量。
应用高分辨率溶解曲线分析在生物学研究中有广泛的应用。
高分辨率熔解曲线及其在分子诊断中的应用
二 、 Ｒ 在分子 诊 断 中的应用 Ｈ Ｍ Ｈ Ｍ 能够 在 没有 标 记 荧 光 探 针 的情 况 下 分 Ｒ 析单个 碱 基 的变 化 。假 如 扩 增 子 包 含 有 一 Ｓ Ｐ Ｎ 位点 Ａ＞Ｃ， 可 能 出现的 双链结 构 为 ２条纯 合双 则 链（ ／ Ａ Ａ和 Ｃ Ｃ） ２条 杂化双 链 （ ／ ／ 和 Ａ Ｔ和 Ｃ Ｇ） ／ ，
结 合 如要 达到饱 和 ， 必须 高浓度 加入 ， 过高 浓度 但
会 抑制 Ｐ Ｒ反 应 ， Ｃ 而饱 和 染 料 不抑 制 Ｐ Ｒ反 应 ， Ｃ 因此 占据 了双链 Ｄ Ａ 的所 有 碱基 对 ， 外 ， Ｎ 此 当双 链 Ｄ Ａ局部解 链 时 ， 离下 来 的染 料 亦不会 重 新 Ｎ 游
文献标 志码： Ａ
高 分 辨 率 熔 解 曲线 及 其 在 分 子 诊 断 中的应 用
沈 薇 综述 ， 傅 启华 审校 （ ．上海 交 通大学 医 学院 附属仁 济 医院检 验科 ， １ 上海 ２ ０２ ； ０ １７ ２ ．上海 交通 大学 医学 院附属 上海儿 童 医学 中心检 验科 ， 上海 ２０２ ） ０ １７ 通 过 加热使 双链 Ｄ Ａ解离 为单链 是 Ｄ Ａ基 Ｎ Ｎ 本 特性 之 一 ， 分 辨 率 熔 解 曲 线 （ ｉ ｅｏｕｏ 高 ｈｇ ｒｓｌｔｎ ｈ ｉ
～
息 ， 如 突 变 、 核 苷 酸 多 态 性 （ｉｇ ｕｌ ｔ ｅ 例 单 ｓ ｌ ｎｃｅ ｉ ｎｅ ｏｄ
HRM
Applied Biosystems7500荧光定量PCR新应用HRM(高分辨率溶解曲线)的高通量基因突变扫描Enid M.ZhaoApplications Specialistcnmcbsupport@Contents●HRM应用的3个特点:●与常规SYBR Green溶解曲线功能相比,HRM的特点:原理熔解曲线7500Software v2.0●New look for the7500and7500Fast Systems with new,moreuser-friendly v2.0software andHRM*capability●Improvements to existing SDSv1.4workflows●Additional features includinggene expression study package ●Versatile interfaces to suitexperienced customers and new users*HRM–High Resolution Melting饱和性染料例如LC Green®Spectra vsSYBR®Green化学:纯荧光谱FAM dye Saturating Dye1 ROX dye SYBR Green dye2.仪器:HRM在溶解曲线阶段要求高捕获率Regular Dissociation High Resolution Dissociation Capture rate~0.2-0.5°C Capture rate~0.1-0.02°C3.HRM数据分析–荧光标准化和生成等位基因特定曲线的温度变化数据工作原理?杂合子样本融解曲线读取高分辨率溶解曲线标准溶解曲线●每个孔扩增产物有一个Tm值HRM图形HRM的发展特点和优势应用应用应用HRM on7500fastHRM on7500fast简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程7500fast HRM应用举例7500fast HRM应用举例Thanks for your attention cnmcbsupport@ 。
高分辨荧光熔解曲线法检测脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子缺失
高分辨荧光熔解曲线法检测脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子缺失欧志英;李丽霞;刘丽;夏慧敏;龚四堂;王凤华;尹应先【摘要】目的探讨高分辨荧光熔解曲线分析在SMNt基因7号外显子缺失检测中的应用. 方法用高分辨荧光熔解曲线分析方法分析脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子纯合缺失、SMNc基因7号外显子纯合缺失及未见SMNt、SMNc完全缺失三种情况. 结果高分辨荧光熔解曲线分析方法能很好地区分SMNt基因7号外显子纯合缺失、SMNc基因7号外显子纯合缺失及未见SMNt、SMNc完全缺失三种基因型,与基因测序方法所得的结果完成一致. 结论高分辨荧光熔解曲线法可用于脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子缺失检测,具有快速、准确、可靠的特点.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2011(003)005【总页数】3页(P300-302)【关键词】脊肌萎缩综合症;高分辨荧光熔解曲线;基因缺失;DNA序列分析【作者】欧志英;李丽霞;刘丽;夏慧敏;龚四堂;王凤华;尹应先【作者单位】广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623【正文语种】中文脊肌萎缩综合症（spinal muscular atrophy，SMA）是一类脊髓前角运动神经元退行性病变所致肌无力与肌萎缩的常染色体隐性遗传病，高加索人群发病率约为1/10000，居致死性常染色体隐性遗传病的第2位，亚洲人携带者频率约为1/56。
SMA主要病理改变表现为脊髓前角运动神经元变性。
运动神经元存活基因SMN与SMA关系密切，是脊肌萎缩综合症的主要致病基因，位于5q13.3区域的两个高度同源的SMN基因，分别位于端粒侧（SMN-t）与着丝粒侧部位（SMN-c）。
人力资源知识高通量低成本SNP突变或甲基化检测方法—HRM技术应用
（人力资源知识）高通量低成本SNP突变或甲基化检测方法—HRM技术应用高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM技术应用HRM介绍HRM技术是high-resolutionmeltinganalysis即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的壹种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点和类型局限，无需序列特异性探针，于PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-S NP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均壹性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler®480和Rotor-Gene6000）和饱和染料（LCGreen、EvaGreen等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用•SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
•新突变的筛查。
•甲基化的筛查。
•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
•HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
•法医学鉴定、亲子鉴定。
•动植物品质关联多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变和性状关联性研究。
HRM特点•高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料
高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料郭心灵;尤崇革【摘要】高分辨率熔解曲线技术(HRM)是近年来发展迅速的一项用于基因突变扫描与检测的新技术.由于具备快速、简便、价廉、高通量和闭管均相检测等优点,HRM已被广泛地应用于突变基因的扫描、基因分型、遗传配型以及法医学鉴定等领域,并受到越来越多的关注且发展迅速.本文就该技术常规应用时的相关仪器与荧光染料的发展及应用进行分析总结.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)001【总页数】4页(P50-53)【关键词】高分辨率熔解曲线技术;聚合酶链反应;荧光染料;PCR仪【作者】郭心灵;尤崇革【作者单位】兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030;兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030【正文语种】中文高分辨率熔解曲线技术（high resolution melting，HRM）是美国Utah大学Wittwer实验室在2003年首次提出的基于新型饱和荧光染料LC Green的发明而进行基因突变检测的新技术[1]。
其基本原理就是利用与荧光染料结合的双链DNA 在温度升高的过程中会发生减色效应的物理性质，通过检测双链DNA在熔解过程中释放的染料荧光信号所形成的特征熔解曲线，进行PCR产物中核苷酸差异的鉴别。
该技术的应用不仅需要饱和荧光染料，而且更需要能进行高分辨检测的定量PCR仪。
近年来用于HRM技术的仪器和染料都在不断更新，朝着操作简便化、试剂专业化的方向发展，在常规检测、疾病诊断、实验室研究、前沿问题研究等方面发挥着重要作用[2,3]。
目前HRM技术可用于基因突变扫描、遗传配型、细菌分型和多重基因分型等领域[4,5]。
本文就HRM技术的常规开展所需要的相关仪器与荧光染料进行综述。
1 HRM仪器常规定量PCR仪由于温控不够灵敏、分辨率不够高及其熔解曲线无法区分熔解温度上差异很小的序列（如单核苷酸多态性、单碱基插入/缺失等），所以不能用于HRM分析。
G6PD缺乏症基因型检测新方法的建立及分子流行特征分析
G6PD缺乏症基因型检测新方法的建立及分子流行特征分析潘美晨;蔡应木【摘要】目的建立葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因型检测的新方法及深入了解梅县地区大学生G6PD缺乏症的流行特征. 方法经G6PD酶活性定量测定法确诊为G6PD缺乏症患者,用高分辨率熔解曲线法检测基因突变类型,对所有样本进行DNA测序验证. 结果 G6PD缺乏症的发病率为7.5％.共发现17种不同的基因型,其中最常见的2种基因型是G6PD Canton( 1376 G＞T)和G6PDKaiping( 1388G＞A),占70％以上；接下来的是G6PD Gaohe( 95 A＞G)、G6PD Union( 1360 C＞T)、G6PD Chinese-4( 392 G＞T)、G6PD Chinese-5( 1024 C ＞T).此外,5.33％( 4/75)的G6PD缺乏症患者没有发现任何突变.结论高分率熔解曲线( high-resolution melting,HRM)是一种快速、廉价、有效的G6PD基因型筛查方法.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)004【总页数】5页(P222-226)【关键词】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症;基因突变;高分辨熔解曲线分析;DNA测序【作者】潘美晨;蔡应木【作者单位】汕头大学医学院第一附属医院检验科,广东,汕头515041;汕头大学医学院第一附属医院检验科,广东,汕头515041【正文语种】中文结论高分率熔解曲线（high-resolution melting，HRM）是一种快速、廉价、有效的G6PD基因型筛查方法。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症俗称蚕豆病，是最常见的遗传性溶血性红细胞酶缺陷病。
该病在全世界分布广泛，全球约有4亿多人受累。
G6PD缺乏症主要由基因突变所引起，其导致G6PD基因表达下降或G6PD酶结构改变，致使G6PD酶活性降低从而影响磷酸戊糖代谢途径，导致NADPH生产障碍，红细胞清除氧化性物质的能力降低而易被氧化性物质攻击破坏引起溶血。
晚期NSCLC患者外周血中EGFR突变检测预测靶向治疗的疗效观察
（ ４５ １ Ｐ： ．３ ；２４３ ４， ００ ８ 。Ｋ ｐａ — ｉｒ ｘ＝ ．６ ， ００ ３ Ｘ＝ ．１ Ｐ＝ ． ） ａ ｌｎ Ｍｅｅ 生存 曲线表 明 ， ３ Ａ组 生存 率 高 于 Ｂ组 （ ２７４ ６， ００ ６ 。 Ｘ＝ ．０ Ｐ＝ ．０ ）
结论 晚期 Ｎ Ｃ Ｃ患 者 可通 过外 周血 检测 出 Ｅ Ｆ ＳＬ Ｇ Ｒ突变 ， 对一 线靶 向治 疗具 有 一定 的指 导意 义 。 【 关键 词 】 小细胞 肺 癌 ； 皮生 长 因子 受体 ； 非 表 外周血 ； 子靶 向 ； 分 治疗
ａａｙｉ． ｈ ｉｅｅｃ ｓｏ ｕｖ ａ ａｅｂ ｔ ｅｎｇｏｐＡ ａ ｄｇｏ ｐＢ ＝ 。０ ， ００ ６ ｗ ｒ ｔ ｉ ｉａ ｙｓ ｎｆ ａ ｔ ｎ ｌｓ Ｔ ｅｄｆ ｒｎ ｅ ｆ ｒｉ ｌ ｔ ｅｗ ｅ ｒｕ ｎ ｕ ７４ ６ Ｐ＝ ． ） ｅｅｓ ｔ ｔ ｌ ｉ ｉｃｎ． ｓ ｆ ｓ ｖ ｒ ｒ ０ ａ ｓｃ ｌ ｇ ｉ
冰 箱 中保存 。 解冻 后 ， 高通 量血 液 Ｄ Ａ提 取试 剂 盒操 作说 按 Ｎ
明提取 Ｄ Ａ， 于 ５ Ｌ灭菌水 中 。经 微量 紫外 可 见分 光光 Ｎ 溶 ０
度 计测 定 Ｄ Ａ 纯 度及 含 量 ，提取 的 Ｄ Ａ放 置一 ０ 冰 箱储 Ｎ Ｎ ２℃
存 。 计上 下游 引 物 。 Ｃ 设 Ｐ Ｒ反 应条 件 为 ９ ℃ ２ｍ ｎ ９ ℃ ５ｓ ６ ｉ ，６ ，
ｗｔｏ ｔＥ Ｆ ｔｔ ｎ （ ｏｐ Ｂ ｅｅｔ ａｅ ｙｃ ｅ ｃ ｒｇ． ｅｕｔ ｈ ａｅｏ Ｇ Ｒ ｍ ｔｔ ｎ ｎ ｐ ｒ ｈｒｌ ｉ ｕ Ｇ Ｒ ｍｕａｉ ｓ ｇ ｕ ）ｗ ｒ ｒ ｔｄ ｂ ｈ ｍｉ ｄｕ ｓ Ｒ ｓｌ Ｔ ｅｒｔ ｆＥ Ｆ ｕａｉ ｓｉ ｅｉ ｅａ ｈ ｏ ｒ ｅ ｌ ａ ｓ ｏ ｐ
hrm甲基化位点检测的敏捷性[常识]
![hrm甲基化位点检测的敏捷性[常识]](https://img.taocdn.com/s3/m/748c46226d175f0e7cd184254b35eefdc8d31564.png)
hrm甲基化位点检测的敏捷性[常识] HRM甲基化位点检测的灵敏性点击次数:142 发布日期:2010-10-12 来源:本站仅供参考，谢绝转载，否则责任自负利用LightScanner上的高分辨熔解曲线进行DNA甲基化位点检测的灵敏性引言DNA甲基化是一种重要的表观遗传CpG二核苷酸修饰形式，异常的DNA甲基化模式发生在许多基因启动子的CpG岛，这会增加患癌症的风险。
CpG岛高甲基化常导致基因沉默，与癌症、老化、基因印记、X-染色体失活密切相关，此外，全基因组CpG高甲基化中也证实了发生在肿瘤形成的早期。
传统的检测甲基化位点的方法是通过重亚硫酸盐处理，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后进行直接测序。
甲基化的胞嘧啶没有发生改变，因此通过测序很容易识别。
本研究中我们系统的评价了通过LightScanner的高分辨溶解曲线检测甲基化的可靠性。
如果这种方法在检测甲基化中是可靠且灵敏度高，就可以减少测序的繁琐过程。
未处理的和经过SssI处理的pBluescript II SK(+)质粒用Qiagen EpiTect试剂盒进行重亚硫酸盐。
通过对有代表性的区域进行测序，确保样品完全甲基化以及亚硫酸盐处理。
引物设计在扩增片段大小在79-216bp的含有1-8个CpG位点的7个不同的片段。
100%甲基化的和未甲基化的样品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的样品可以明显的区分开。
当两个样品按以上比例混合后，熔解曲线表现出重复的剂量放映关系，当50%混合时与未甲基化的标准品偏性最大。
高分辨溶解曲线的灵敏度足够检测甲基化位点，对小片段的灵敏度可达到2%,大片段的可以10%。
重要的DNA甲基化位点显示在B淋巴细胞增生性疾病，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)中。
瘤抑制基因的外部沉默可以通过DNA甲基化抑制剂处理而发生转变。
高分辨率溶解曲线HRM
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
25:67–90
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
高分辨熔解曲线技术及其临床应用进展
高分辨熔解曲线技术及其临床应用进展李瑜琴;刘权贤;袁阳;张建勇;陈玲【摘要】High-resolution melting(HRM)is a new technology of new gene analysis based on monitoring dou-ble-stranded DNA melting process with saturated fluorescent dyes in real time to reflect the amplicon DNA sequence characteristics.The technology has the advantages of fast,high efficiency,high specificity,low pollution,and low cost. Therefore,it has been widely used in clinical medicine,bioscience,forensic medicine,herbs and food identification and other fields.This paper reviews the basic principles,key factors,and clinical application of HRM.%高分辨率熔解曲线(HRM)技术是一种通过饱和荧光染料实时监测双链DNA的熔解过程,以此反映扩增子DNA序列特性的基因分析新技术.该技术具有快速、高效、高特异性、污染小、廉价等优点,目前已广泛应用于临床医学、生命科学、法医学、药材和食品鉴定领域.本文对高分辨率熔解曲线技术及其在临床医学的应用进行综述.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2018(029)007【总页数】3页(P984-986)【关键词】高分辨率熔解曲线技术;医学;应用;进展【作者】李瑜琴;刘权贤;袁阳;张建勇;陈玲【作者单位】遵义医学院附属医院呼吸二科,贵州遵义563000;遵义医学院附属医院呼吸二科,贵州遵义563000;遵义医学院附属医院呼吸二科,贵州遵义563000;遵义医学院附属医院呼吸二科,贵州遵义563000;遵义医学院附属医院呼吸二科,贵州遵义563000【正文语种】中文【中图分类】R392.13高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)技术是由美国Idaho公司与美国犹他大学Carl Wittwer实验室于2003年合作开发的一种建立在实时荧光定量PCR(RT-PCR)基础上的新技术[1-2]，具有准确、闭管操作、快速、廉价、污染小等优点[3]。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。
它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。
HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。
在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。
然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。
同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。
当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。
而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。
根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。
HRM技术具有多个优点。
首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。
其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。
此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。
HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。
在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。
在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。
尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。
高分辨溶解(HRM)分析
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 基因的突变扫描： 前后重复、杂合子缺失。 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
高分辨溶解（ 第二课 高分辨溶解（HRM）分析 ）
hnxide@
高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution melting curve）是一种广泛应用于基因分型、突变检测和SNP分析等领域的检测技术。
其基本原理是利用荧光染料与DNA双链结合，随着温度的升高，DNA双链会逐渐解旋，导致荧光强度的变化。
通过检测荧光信号的变化，可以获得一条关于温度的曲线，称为溶解曲线。
高分辨率溶解曲线分析的优势在于其高灵敏度和高分辨率。
它可以快速、准确地检测出不同DNA序列之间的差异，甚至能够区分相似度达到99.99%的DNA序列。
这使得高分辨率溶解曲线成为一种非常重要的基因分型和突变检测技术。
高分辨率溶解曲线的操作相对简单，通常包括以下几个步骤：1.样品准备：从生物样本中提取DNA，并进行纯化和扩增，以获得足够的DNA量。
2. PCR扩增：选择适当的引物，进行PCR反应，扩增目标DNA片段。
3.荧光染料加入：在PCR反应结束时，将荧光染料加入PCR体系中。
荧光染料可以与双链DNA结合，从而产生荧光信号。
4.温度梯度扫描：利用PCR仪器进行温度梯度扫描。
通过逐渐升高温度，将DNA片段逐渐解旋，并观察荧光信号的变化。
5.数据分析：通过对荧光信号进行分析，可以得到一条溶解曲线。
根据曲线的形状和荧光峰值的位置，可以判断样品中的DNA序列。
高分辨率溶解曲线的分析可以被广泛应用于许多领域，例如基因分型、突变检测、SNP分析等。
在基因分型中，通过对多个基因位点的高分辨率溶解曲线进行分析，可以确定个体的基因型。
在突变检测中，溶解曲线的形状和荧光峰值的位置可以指示是否存在DNA序列的突变。
而SNP分析则是通过溶解曲线的变化来检测单核苷酸多态性。
除了上述应用之外，高分辨率溶解曲线还可以被用于测定DNA的荧光特性和结构特点。
通过观察溶解曲线的形状和荧光峰值的位置，可以获得DNA的熔解温度、熔解曲线宽度等信息，进而了解DNA序列的稳定性和结构特点。
总之，高分辨率溶解曲线是一种重要的基因分型和突变检测技术。
高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解曲线（HRM）技术的应用举例HRM应用举例1 突变筛查HRM的特点是高灵敏度和高特异性，检测灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测出已知突变，也能检测出未知突变。
在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析（表1）。
表1、突变检测方法的比较研究方法优点缺点直接测序法突变检测金标准，能发现已知和未知突变位点每个位点均需要经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本、少位点的样本检测，容易交叉污染。
Taqman探针法适合已知突变位点、位点数量少、通量高的检测价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知突变位点普通PCR方法技术简便，价格便宜，仅适用已知SNP判断，不能确定何种突变，适宜少量样本检测费时费力，速度较慢，灵敏度差；RFLP仅能检测有酶切位点的片断，无酶切位点不能检测；上述方法都需要凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。
SSCP、DGGE花费时间长、稳定性差、灵敏度有限，难以大规模开展工作。
芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点仅适用于全基因组扫描，不适宜单个或少数基因的突变位点检测，精度低，价格昂贵。
Illumina技术这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。
高通量检测，在全基因组上扫描分析上有优势，价格昂贵。
MALDI-TOF MS 质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰，如盐离子含量等，适宜于已经优化的特定突变检测，不适宜该服务商未做过或很少做过的新突变检测。
检测过程需要多点质控，否则精确度很低。
另外，很重要的一点是过程复杂：PCR+电泳+割胶+纯化等，最后才是质谱监测，PCR需要自己做，并不便宜。
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高分辨熔解曲线突变检测
高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理
HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用
HRM应用：
•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁
•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变
•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失
•特定突变、多态性位点的筛选
•外显子和短扩增子基因型扫描
HRM特点：
•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
•特异性好：HRM的特异性可以达到90-100%。
短的扩增子特异性要更高
•不受碱基位点局限，适用范围广
•在封闭的试管内进行，可降低污染操作简单
•成本低廉、时间少、误差小、高通量检测
•检测的样品范围广：HRM检测片段范围在38-1000bp不同来源的样品都可以用于HRM如血粉、口腔细胞、冷冻的肿瘤样品、也可用于酒精固定、福尔马林固定或石蜡包埋的组织等，在人类遗传性疾病的研究中，通常用周边血液淋巴细胞中提取DNA，用于HRM分析。
HRM：实验设计中需要考虑的问题
•高效的扩增方案的设计对于HRM的成功至关重要。
最大的灵敏度和特异性有助于最佳的PCR结果的产生，同时扩增子的溶解特性对于结果也非常重
要。
这取决于引物的设计和引物的位置。
•在实验结果中有时会出现假阳性，这时可以通过调整引物或者扩增参数避免出现假阴性的结果。
•样品的质量对特异性有一定的影响，因此，进行HRM分析时要选用高质量的样品。
总结
HRM灵敏度高、特异性好
该方法是在封闭的试管内进行，可降低污染，因此，该技术具有操作简单、成本低廉、时间少、误差小、高通量检测的优点。
是进行突变扫描的首选方法。