虎纹蛙微卫星位点的跨种引物筛选

得 了较低 的跨种扩增成功 率。研 究结果显示仅有 １ （ ３ ． ％ ） 点在 虎纹 蛙能 够获得成 功扩增 ， ０个 约 ３ ３ 位 而其 中仅 有 ２个
（ ６７ ） 点的扩增 结果是 没有 拖带和非特异性的物种特异性扩增 ； ．％的住 点完全没 有扩增产物 ， ２％的位 点 约 ．％ 位 ４ ７ ６ 而 ０
２ｌ Ｏ １年 ２月
湖北第二师范学院学报
Ｊ ｕｎ ｌｏ ｌ ｉｅｓｔ ｆＥ ｕ ａｉｎ ｏ ｒａ ｆ Ｈｕ￣ｉＵｎｖ ｒｉ ｏ ｄ ｃｔｏ ｙ
Ｆ ｂ ２ １ ｅ．Ｏ １
第 ２ 卷第 ２期 ８
Ｖ０． ８ Ｎｏ ２ １２ ．
虎 纹 蛙微 卫 星位 点 的跨 种 引物 筛选
陈 东海 邵 晨 王 宇２ ， ，
外凝胶成像系统。 １３ 微卫星位点的选取 ．
多态性、 选择 中性、 信息含量大、 呈共显性等特点 ， 因而 被广泛应用 于分 析种群遗 传结构 和遗传 多样性ｌ ］ ４ ，
基因流［７， ６１种群进化史 和物种判定 等研究领域。 ， 。
从 Ｇ ｎａｋ和已发表的两栖类物种 中选择 了 ３ ｅｂｎ Ｏ 对具有高度多态性的微卫星位点 。 。坫作为候选引物 ，
因此本文采用近缘物种跨种扩增的方法对虎纹蛙
Hale Waihona Puke Baidu
的微卫星位点进行引物筛选 ， 以期为该物种遗传多样 性和遗传结构的检测及无尾 目物种跨种扩增的后续相
关研究提供基础资料 。
１ 材料 和方 法
３ｓ退火温度退火 ３ ｓ７ ￣延伸 ４ ｓ最后再 ７ ￣延 ５， ５ ，２ Ｃ ５； ２ Ｃ 伸 ｌｍｎ Ｏ ｉ。其 中退火温度采用温度梯度（ ８ ４ ￣ ６ ℃） Ｃ一 ０ 来执行。对于有扩增 产物的位点 ， 优化其反应条件和 反应体系， 直至获得单一 、 稳定的扩增结果。 将 Ｐ Ｒ扩增后 的结果按照有无 目的条带、 Ｃ 涂带和
种扩增也被认为是获得微卫星位点 的方法中最为经济
的方法 。
Ｐ Ｒ反应总体系为 ２ ， Ｃ ５ 包括 ： 模版 Ｄ Ａ８ ｇ Ｎ ｎ； ０ 引物 ０ １ ａ ｌ ；ｒ — ｃ １ ｍ ｌ ；ｃ５ ｔ ｌ ．２０ ｏ Ｌ Ｔｉ Ｈ ｌ ０ｍ ｏ Ｌ Ｋ ｌ０ｒ ｏ ｎ／ ｓ ／ ｅ ／ ｏ
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ：６４３４ ２ １ ）２０ ３ －４ １７ －４ Ｘ（０ １ ０ － ７０ ０
基 金项 目 ： 浙江省 自然科 学基金 项 目（ ５ ６ ３ ） 浙 江省科技计划重点项 目（０ ８ ２０ ７ Ｙ ０２ ４ ； ２０ １ ２ ５ ） ２ 作者简 介 ： 东海 （９ ２一） 男， 宁沈 阳人 ， 士研 究生， 究方向为两栖 类保 护遗传 学与分子 生态学。 陈 １８ ， 辽 硕 研
对虎纹蛙基 因组 Ｄ Ａ进行跨种 Ｐ Ｒ扩增。微卫星引 Ｎ Ｃ 物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 １４ 跨种 Ｐ Ｒ扩增及检测 ． Ｃ
微卫星位点左右的侧翼序列在近缘物种间是相对保守
的， 因而通过近缘物种跨种扩增 以获得所需物种的微 卫星序列被认为是可行 的。此外引用近缘物种进行跨
构产生显著的影响。 微卫星 （ ｉ ｓ ｅｉ ） ｍｃ ａ ｌｔ 分子标记 由于具有高度 的 ｍ ｔｌｅ
司； 主要仪器包括 ： ｐｅｄｆ５ １Ｒ高速冷冻离心机； Ｅ ｐｎ ｏ ７ ４
Ｅ ｐｎｏ 恒 温 混 匀 仪 ； ｈｒ ｏ Ｎ 干燥 仪； Ｉ — ｐｅｄｆ Ｔｅ Ｄ Ａ ｍ ＢＯ Ｒ Ｄ电泳仪 ；Ｉ Ａ ＢＯ—Ｒ Ｄ梯度 Ｐ Ｒ仪 ；Ｉ Ａ Ｃ ＢＯ—Ｐ Ｄ紫 Ａ
护野生动物 ， 同时被列 入 ＣＴ Ｓ附录二 和《 ＩＥ 中国物种 红色名录》 易危等级 。近年来 由于栖息地破坏、 Ｊ 过
度捕猎 以及人们传统饮食文化消费 的影响 ， 虎纹蛙野
生种群数量急剧下降。为 了满足人们 日 益增长的消费
需求 ， 大量泰国虎纹蛙种群被引入 国内进行人工养殖 ， 同时还与本 地种群 进行杂交繁育 。这种繁育 方式 Ｊ 和大规模的种群下降会对物种的遗传多样性和遗传结
Ｌ ｄ ＇ ．５ｍ ｏ Ｌ Ｔ ｑ０ ７ Ｍ Ｃ２ 采用 １ ５ ：Ｎ Ｐ０ １ ｍ ｌ ；ａ ．５Ｕ； ｇ１： ｒ ／ ． ｍ ｌＬ， ． ｍｏ Ｌ和 ２ ５ｍｍ ｌＬ三 个 浓度 梯 度 。 ｍｏ ／ ２０ｍ ｌ ／ ． ｏ／ 反应条件为 ：５ 预变性 ５ ｉ； ９￣ Ｃ ｍｎ３ ５个循环 的９ ℃变性 ５
虎 纹 蛙 （ ｏｌ ａ ａｈ ｓｍｇｌｓｓ 主要 分 布 于我 Ｈ ｐｏ ｌ ｃｕ ｕｏｕ） ｂｒ 国南方诸省及东南 亚少数 国家－ ， １ 是我 国国家二级保 ］
法 提 取基 因组 Ｄ Ａ， 解 于 Ｔ （ ． １ ｏ ＬＴｉ— Ｎ 溶 Ｅ ００ ｍ ｌ ｒ ／ ｓ
Ｈ ｌ ．ｍ ｌＬＥ Ｔ Ｐ ８０ 中， ｃ， １ ｏ Ｄ Ａ，Ｈ ． ） 利用紫外分光光度计 ０ ／ 测定样 品浓度和纯度 ， 保存于 一 ０ ２ ℃保存备用。 １２ 主要试剂和仪器 ． 用 于 Ｐ Ｒ 反 应 的 ｄ Ｔ Ｓ 、 ａ Ｎ 聚 合 酶 及 Ｃ Ｎ Ｐ Ｔｑ Ｄ Ａ Ｄ ２０ Ｎ ａ ｅ 均购 自宝生物工程（ Ｌ００Ｄ ＡＭ ｒ ｒ ｋ 大连） 有限公
（． １浙江师范大学 生态研 究所 ， 浙江 金华 ３ １０ ； ． ２０４ ２ 浙江大学 生命科学学院， 杭州 ３０５ ） １０ ８
摘 要 ： 用近缘 种 中已发 表的微卫 星 Ｄ Ａ标记 引物， 利 Ｎ 对虎纹蛙 （ ｏｌ ａ ａｈｓｒｇｌ ｌ ） Ｈ ｐ ｂｔ ｃｕ ｌｌｏ ｌ 进行跨 种 Ｐ Ｒ 扩增 ， ｏ ｒ ｌ ｌｓＢ Ｃ 但是获
产 物为该位 点的非特异性 扩增。本文认为影响 爵栖纲无尾 目物种跨种扩增成功率 的因素 除 了与该类群物种的基 因组 大
小有 关外， 与两栖 类物种 间的 亲缘 关 系 还 远近 有关。
关键词 ： 卫星 ； 微 跨种扩增 ； 因组 ； 基 亲缘关 系； 虎纹蛙
中图分 类号 ： ３ Ｑ４