高效液相色谱法测定多种维生素多种矿物质片中的维生素D3含量

高效液相色谱法测定多种维生素

多种矿物质片中的维生素D3含量

韦月早1杨世联2黄艳芳2韦艳妮2

（1.广西壮族自治区产品质量检验研究院，广西南宁530007；

2.南宁富莱欣生物科技有限公司，广西南宁530007）

【摘要】建立高效液相色谱法快速测定多种维生素多种矿物质片中维生素D3的含量，并采用加标回收率试验进行方法确认。样品在0.2%的氨水中用碱性蛋白酶破坏维生素D3的包埋物质，用乙醇浸提，正己烷萃取游离出维生素D3。供试品溶液用正相液相色谱法净化，反相液相色谱法分离。维生素D3在0.0498μg/mL～0.9963μg/mL浓度范围内线性关系良好（r＝0.9999），平均加标回收率为97.78％，RSD为3.26％，精密度和稳定性良好，RSD分别为2.69％和1.58％。该方法准确、快速，可作为多种维生素多种矿物质片中维生素D3含量的测定方法。

【关键词】高效液相色谱法；多种维生素多种矿物质片；维生素D3

【中图分类号】R927【文献标识码】A【文章编号】1008-1151(2019)06-0040-03 Determination of Vitamin D3 in Multiple Vitamins and Minerals Tablet

by High Performance Liquid Chromatography

Abstract: A rapid method for the determination of vitamin D3 in multiple vitamins and minerals tablet by high performance liquid chromatography was established. The method was confirmed by standard-added recovery test. In 0.2% ammonia water, the encapsulated substance of vitamin D3 was destroyed by alkaline protease. Vitamin D3 was extracted by ethanol and n-hexane. The sample solution was purified by normal phase liquid chromatography and separated by reversed phase liquid chromatography. The linear relationship of vitamin D3 was good in the concentration range of 0.0498μg/mL to 0.9963μg/mL (r＝0.9999). The average recovery of standard addition was 97.78%, RSD was 3.26%. The precision and stability of vitamin D3 were good, RSD were 2.69% and 1.58%, respectively. The method is accurate and rapid, and can be used for the determination of vitamin D3 in multiple vitamins and minerals tablet.

Key words: high performance liquid chromatography; multiple vitamins and minerals tablet; vitamin D3

1 引言

维生素D是一种脂溶性维生素和激素前体，具抗佝偻病和软骨病作用。阳光照射皮肤和膳食是人体维生素D的主要来源，又以前者为主。它有五种化合物，其中维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇）对健康有着密切的关系。然而，现代生活方式使人们接触阳光的机会越来越少，一般膳食中维生素D含量又不高，人们需要依靠含有维生素D的营养补充剂来满足对维生素D的需要[1,2]。含有维生素D3的保健食品越来越多，有粉剂、片剂、胶囊剂。目前，维生素D3含量测定方法最常用的是高效液相色谱法，样品的前处理制备是测定维生素D3的关键步骤。有的需要先水浴回流皂化，再用分液漏斗多次洗涤萃取分离[3-5]，操作繁琐，容易损失，重现性差，分析成本高；有的需要二甲基亚砜-水溶液提取，正己烷多次萃取[6-8]，试剂毒性大，危害人体健康，操作复杂、又耗时；针对组分单一的软胶囊，可以用单纯的甲醇溶剂超声溶解提取[9]。因此建立一种简单快捷、针对性的前处理方法对维生素D3含量测定是很有必要的。多种维生素多种矿物质片是以维生素和矿物质等为主要原料制成的保健食品，本文在碱性条件下，采用碱性蛋白酶酶解样品20min，无水乙醇浸提5min，再用正己烷等比例萃取5min，即可将维生素D3与其中的矿物质和维生素等干扰组分分离。该方法样品制备前处理简单，成本低，易于操作，适合大批量样品的测定。

2 实验仪器与材料

2.1实验仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，配有UV检测器（美国waters公司）；KQ5200DV型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HMS-350型漩涡混合器（天津市恒奥科技发展有限公司），80-4型电动离心机（金坛市医疗仪器厂）；梅特勒-托利多AUY220电子天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；

总第21卷238期大众科技Vol.21 No.6 2019年6月Popular Science & Technology June 2019

【收稿日期】2019-04-09

【作者简介】韦月早（1984－），供职于广西壮族自治区产品质量检验研究院，从事环境检测工作。

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Evolution 201紫外可见分光光度计（美国Thermo公司）。

2.2实验试剂与样品

甲醇、无水乙醇（德国merck公司，色谱纯），正己烷、环己烷（天津科密欧化学试剂有限公司，色谱纯），氨水，无水乙醇（广东光华科技股份有限公司，分析纯），水解蛋白酶Alcalase （诺维信（中国）生物技术有限公司），维生素D3标准品（德国DR公司，批号：100656 CAS：67-97-0），氮气（99.999%），氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司，HSC-17-12B），多种维生素多种矿物质片（批次：0301、0302、0303、0304、0305、0306，标示量为1.5μg/片，1000mg/片，美国HPSON公司）。

3 实验部分

3.1色谱条件

3.1.1半制备正相液相色谱条件

色谱柱为Si60Inertsil SIL-100A（5μm 4.6×250mm）；流动相为正己烷＋环己烷＝1＋1，再按体积比加0.8%异丙醇；检测波长为264nm；流速为1.0mL/min；柱温35℃±1℃；进样量为200μL，理论板数按VD3计不低于5000，此条件下VD3与其他成分分离度不低于1.5。

3.1.2反相液相色谱条件

色谱柱为C18wondasil TM C18（4.6×250mm，5μm）；流动相为甲醇；检测波长为264nm；流速为1.0mL/min；柱温35℃±1℃；进样量为100μL。

3.2维生素D3标准溶液的配制

3.2.1维生素D3标准储备溶液

准确称量维生素D3标准品10.0mg，用色谱纯无水乙醇溶解并转移定容至100mL棕色容量瓶，其浓度约为100μg/mL。

3.2.2维生素D3标准中间液

精密量取10mL，置于100mL棕色容量瓶中，加色谱纯无水乙醇稀释至刻度，混匀，浓度约为10μg/mL。临用前，用紫外分光光度法校正其浓度[4]，以无水乙醇为空白参比，用1cm石英比色皿，在264nm处测定吸光度A（A平均值为0.4603），按公式

（1）计算其中

）。

（1）

3.2.3维生素D3标准使用液

分别准确吸取维生素D3标准中间使用液0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、10.00mL于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别约为

0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、

1.00μg/mL，准确浓度按校正后的浓度折算。

3.3分析测定步骤

3.3.1浓缩与净化

分别取每批本品20粒，研磨均匀后，取2.0g（精确至0.0001g）置于25mL容量瓶中，加300mg碱性蛋白酶，5mL0.02%氨水，于65℃水浴超声提取20min，取出冷却后再加15mL无水乙醇室温超声5min，冷却后，加无水乙醇定容至25mL，精密吸取10mL上清液于预先加有10.00mL正己烷、5mL水的50mL棕色容量瓶中，震荡，充分混匀后取部分溶液离心5min，取上层5.00mL，于40℃±2℃水浴氮气吹干，用正己烷定容至1mL（浓缩了5倍），经0.45μm微孔滤膜过滤供半制备正相高效色谱系统半制备，净化待测液。

3.3.2半制备正相高效液相色谱系统适用性试验

取约1.00mL维生素D3标准中间使用液于10mL具塞试管中,在40℃±2℃的氮吹仪上吹干。残渣用10mL正己烷振荡溶解。取该溶液100μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D3保留时间。然后将200μL待测液注入液相色谱仪中，根据维生素D3标准溶液保留时间收集维生素D3馏分于试管中。将试管置于40℃±2℃水浴氮气吹干，取出，准确加入1.0mL 甲醇（稀释了5倍），残渣振荡溶解，即为维生素D3测定液。

3.4上机测定

分别将维生素D3标准系列工作液和样品测定液100μL注入反相液相色谱仪中，得到维生素D3的峰面积。以峰面积为纵坐标，维生素D3工作液浓度为横坐标绘制标准曲线，以外标法计算供试品的维生素D3含量。对照液和供试液的色谱图如图1和图2所示。

图1对照液色谱图

图2供试液色谱图

4 实验结果

4.1线性关系考察、检出限及定量线

分别将各标准系列浓度100μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以维生素D3的质量浓度（μg/mL）

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