测量红细胞变形性的新方法

测量红细胞变形性的新方法

严宗毅　综述

北京大学力学与工程科学系(100871)

摘要　本文综述了在测量红细胞变形性方面的国外最新进展。新发明的细胞过孔分析仪不仅能测得大量红细胞通过微孔滤膜的平均时间,还能给出其统计分布。在微孔过滤试验中采用不同粘度的悬浮介质,或在流动小室中使用新的光度法观测,能够进一步分辨出红细胞变形性的改变到底是由细胞的哪些力学性质的改变所引起的。在激光衍射仪中采用低粘度介质和动态松驰的方法能够得到细胞变形与取向两项指标,敏感地反映细胞膜物理化学性质的变化。

关键词　红细胞变形性　细胞膜弹性　细胞膜粘性　细胞过孔分析仪　微孔滤膜　激光衍射法　血液流变学

1　引言

红细胞变形性是血液流变学的重要指标之一[1～3]。决定红细胞变形性的内在因素有: (1)细胞膜的弹性和粘性;(2)细胞的几何形状;(3)细胞内液的粘度。临床研究表明,许多疾病能使上述的一个或几个因素发生改变,从而引起红细胞变形性的变化。因此,测定红细胞变形性对于许多疾病的预防与诊断有重要意义。

测定红细胞变形性的方法有两大类型:即红细胞通过狭窄通道的方法(例如测试单个细胞的微吸管法和测试大量细胞的微孔滤膜法),以及红细胞悬浮液在较大尺度的测定系统中经受剪切的方法(例如激光衍射法)。80年代末期以来测定方法有了新的发展,主要体现在不仅能测定大量红细胞的平均变形性,还能方便地给出它们的统计分布;不仅能测定红细胞变形性的改变,还能深入探讨这些改变是由哪种内在因素的改变引起的。下面就对这些新进展做一简介。2　细胞过孔分析仪(CT A)

在微循环中即使只有2～3%的红细胞变形性很差,也会不成比例地严重影响红细胞通过微血管的流动[2]。因此,国际血液学标准化委员会建议,不仅要测定红细胞的平均变形性,而且希望得到它的统计分布。以往的微吸管法[4]或单孔过滤法[5]测量的细胞数目太少、操作太慢,无法给出足够多的数据供统计分析之用。1988年,Koutso uris等人[6,7]发明了细胞过孔分析仪(Cell T ransit Anal-yser,简称CTA),可以在1分钟内分析上千个红细胞通过滤膜时间的分布,随后由法国的ABX公司制成商品仪器,得到临床应用。

细胞过孔分析仪用一块滤膜把红细胞稀悬浮液(压积0.04%)与缓冲液分开,膜上有约30个尺寸相同的微孔(直径约5 m,长约10～20 m)。当红细胞在压差驱动下流过膜孔时,与膜两侧电极相连的电导仪上电位发生变化,记录下脉冲波形,经计算机处理给出红细胞过孔时间的平均值及其分布的直方图。这一仪器还能利用电信号的特征自动剔

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国家自然科学基金资助项目

除两个或多个膜孔同时有细胞通过的数据以及混入悬浮液中的少量白细胞过孔的数据,从而使所得红细胞变形性数据更为可靠。图1所示的典型结果是将高速离心获得的比较年轻的红细胞(顶部)和比较年老的红细胞((底部),分别悬浮于含5mM DNP(二硝基酚)的缓冲液,再以1∶1比例混和后测得的。注意,这一分布有两个峰值,分别对应于年轻与年老红细胞这两个亚群,经DNP 处理的年老细胞比同样处理的年轻细胞平均过孔速度低22%(未经处理的年老细胞仅比年轻细胞慢9%)。如果不用CT A ,而用通常的微孔过滤法,只能测得混和物过孔时间的平均值,

无法分辨其中存在亚群。

图1　年轻与年老红细胞混和物过孔时间的直方图(L =21.0 m,D =4.5 m)

纵坐标为分布的细胞数目:左侧线性标尺对应于涂黑曲线,右侧对数标尺对应于空心曲线,横坐标为过孔时间,N 是测量的细胞数目,〈 〉

是平均过孔时间1992年,Fisher 等人[8]为CTA 设计了新软件,从每一个电信号可以提取出8个参数。经过试验,其中脉冲高度(H )与平均细胞体积(MCV )线性相关,脉冲上升时间(RT )与下落时间(FT )之比对于红细胞膜硬化(如加戊二醛)以及细胞形状与内粘度变化(如改变渗透压)都非常敏感。

3　在微孔过滤法中使用高粘度缓冲液

在微孔过滤法[3]中,分别测定等量的纯缓冲液和红细胞悬浮液流过滤膜所需的时间t b 和t s ,然后计算红细胞刚度指数IR:

IR =t s -t b t b 1

H

(1)式中H 是悬浮液中的红细胞压积。只要H<0.1,IR 几乎与H 无关。显然,IR 越大,说明红细胞越不容易变形。

但是,以往人们并不知道IR 的改变所反映的红细胞变形性改变到底是由哪一内在因素的变化所引起的。1982年,Kiesew etter 等人[9]指出,对于通常所用的低粘度缓冲液,红细胞通过单个微孔(直径5.8 m )的时间随缓冲液渗透压增大而变大:由低渗(200m Osm /kg )时18.4±8.6m s 到正常(300m Osm/kg )时的28.0±9.1ms,再到高渗(480m Osm/kg )时的46.8±11.4ms 。我们知道,渗透压升高时细胞体积稍减(使过孔变快)而细胞内血红蛋白浓度增高(因而细胞内粘度升高使过孔变慢),看来内粘度升高是使红细胞过孔时间增大的主要原因。这说明,采用低粘度缓冲液的微孔过滤法能够探测出由于内粘度改变所引起的红细胞变形性改变。

但是,试验表明,采用低粘度缓冲液的微孔过滤法却探测不出由于细胞膜弹性改变所引起的红细胞变形性改变。1993年,Drochon 等人[10]改用高粘度缓冲液,发现这时微孔过滤法的IR 主要反映红细胞膜弹性的改变。为了证实这一点,他们把同一来源的红细胞分成两组,一组用含有0.05至0.1mM 的二酰胺悬浮液孵育(称为T 组),另一组未经二酰胺处理,作为对照(称为N 组)。二酰胺(di-amide )的作用是使红细胞膜刚度增大〔用微吸管法测定两组的剪切弹性模量E,T 组和N 组分别为(11.6±2.3)×10-6

和(4.6±0.9)×10-6M /m 〕,但并不改变细胞内液的性质,也不影响细胞的形状。所以两组细胞测量结果的差异将反映红细胞膜弹性变化的影响(表1)。测量结束之后,用光学显微镜观察滤膜,没有发现明显的膜孔堵塞。

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