分子生物学之转化技术

操作步骤
• • 1.制备Inoue转化缓冲液（用前冰上预冷。）用超纯水（Milli－Q过滤水）配制。 A. 0.5M PIPES (pH6.7)[哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)]溶液的配制:将15.1g PIPES 溶于80ml 超纯水中,用5 M KOH调pH值至6.7，最后加纯水，定容至100ml。用预先处理的Nalgene滤 膜(0.45m孔径)过滤除菌。分成小份于－20 0C保存。 B. Inoue转化缓冲液的配制:将下列组分溶于800ml纯水中，然后加20ml 0.5 M 的PIPES （pH6.7），加纯水定容至1L。 试剂 需要量／L 终浓度 MnCl2.4H2O 10.88g 55 mM CaCl2.2H2O 2.20g 15mM KCl 18.65g 250mM PIPES (0.5M, pH6.7) 20 ml 10mM H2O 补至1L C. 用预先处理的Nalgene滤膜（ 0.45m孔径）过滤除菌，分成小份于－20 C 保存。
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CaCl2转化法获得高转化效率的关键
• 1、制备感受态所用的水最好用超纯水，尽可能使用新买的生化试剂配 制培养基、化学溶液和制备感受态。如果可能，最好用国外的原装试剂 来配制培养基和化学溶液。 • 2、本方法中的CaCl2应该用CaCl2· 2H20,MgCl2应该用MgCl2· 6H2O,这样可获 得最佳的转化结果。另外CaCl2和MgCl2最好都用国外产的试剂，以保证 最佳转化效率。 • 3、细菌的生长状态：由于未知的原因，最高的转化效率总是用直接取 自冻存于-70C的储备液中直接培养获得的，因此，不应使用在实验室 中连续传代或存放于4 C或室温的培养物。 • 4、玻璃和塑料器皿的清洁。 微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅度地 降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于 其他目的的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（Mini －Q水或相当的水）充满，再经高温高压消毒。水在玻璃器皿使用前应 倒掉。
本方法需要的缓冲液和溶液
• 二甲基亚砜（DMSO） • 二甲基亚砜的氧化产物是转化的抑制物，为避免上述问题， 应购买高质量的DMSO。 • Inoue转化缓冲液（见后面） • 用前臵于冰上预冷至0C。 • 培养基：LB，SOB，SOC。 • 专用设备： • 液氮 • 18 C 摇床。 • 42 C恒温水浴。
化学转化法概述
• 用简单的盐溶液（如CaCl2等）处理大肠杆菌细胞，使其细胞膜的通 透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Competent cells)。这种转化外源DNA的方法称为化学法。现在大部 分应用于细菌转化的化学方法都基于Mandel和Higa的实验结果，他们 发现细菌用冰冷的CaCl2处理后，在37˚C或42˚C加热能够被噬菌体DNA 转染。同样的方法随后也被应用于以质粒DNA和大肠杆菌染色体DNA转 化细菌。对于每微克超螺旋DNA，这种简单而有效的方法通常能产生 105和106个大肠杆菌的转化克隆，这种转化效率对于很多常规的工作 如质粒转化或载体的构建已经足够了。然而当可能得到的每一个克隆 都相当重要时，例如，构建cDNA文库或只有很少的目的外源DNA可以 利用时，较高的转化效率是必需的。通过对最初的CaCl2转化方法的 一系列改良，现在的化学转化方法由每微克超螺旋质粒DNA通常可获 得数量为106-109的转化子，实验方法的改进使转化效率不再是分子克 隆中的一个限制因素而被取消了。化学转化法简便易行,不需要特殊 的试剂和仪器，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出 的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保 存(可保存半年而转化效率没有明显的下降),因此目前化学转化法是 分子生物学实验室使用最广泛的一种转化方法。
Solutions:
• 1. Mg++ solution: • • 1M MgCl2 12 ml 1M Tris, pH 7.5 1.2 ml • H2O up to 120 ml • • • 3. Ca++ glycerol: • • 42.5 ml Ca++ solution + 7.5ml Glycerol 2. Ca++ solution: 1M CaCl2 15 ml 1M Tris, pH 7.5 1.5 ml H2O up to 150 ml
最经典、最可靠的化学转化法： CaCl2法
• CaCl2转化法的效率： • 5 106 -2 107个转化克隆／g超螺旋质粒DNA。(转化效率的计算： 0.1ng标准质粒如pUC18转化感受态细胞后，通常得到1ml转化液。涂布 100 l长出100个菌落，则转化效率为：100X10X104=107转化克隆／g超 螺旋质粒DNA) • 改良的CaCl2转化法（个人方法）： • 转化效率介于107－108左右，比传统的氯化钙法高10－100倍。类似于分 子克隆第三版上的CaCl2转化法，但有些区别。 • CaCl2转化法优点： • 重复性好，对操作技术要求不高，对DNA纯度、试剂质量要求不高（但是 熟练而细心的操作、纯的Βιβλιοθήκη BaiduNA样品和高质量的试剂仍然能获得最好的结 果）； • CaCl2转化法缺点： • 转化效率不高，一般仅用于载体构建，不用于建库。
Hanahan转化法
• 20世纪70年代晚期和80年代早期，Dong Hanahan 在冷泉港实验室和哈佛大学做研究生的时候，他 做出了以前从未听说过的转化效率，并且以后他 的方法被标准化了, 称为Hanahan转化法。 • 如果足够细心，用Hanahan的方法可获得高达 5X108的转化效率。可事实上只有少数人能够重复 出Hanahan本人的高转化效率。 • 由于该方法对操起技巧和细心程度要求较高，重 复性低，这里不做介绍。有兴趣的同学可参考分 子克隆上的步骤进行尝试。
Inoue方法制备超级感受态方法
• 用化学方法制备超级感受态的方法主要有：Hanahan的方法和Inoue的方 法。 • 采用Hanahan的方法一般可以达到5 108个转化克隆／g超螺旋质粒DNA， 而采用Inoue的方法一般可以达到1 108 -3 108个转化克隆／g超螺 旋质粒DNA。 • 与上一种制备超级感受态的Hanahan的方法相比，Inoue方法的优点在于 并不过分地讲究细节，但是重复性更好。这一方法与其他方法有所不同 的是细菌在18 0C进行培养而不是通常的37 0C。否则这个方法就没有什 么特别之处。没人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率。也许 是18 0C时合成的菌膜成份和物理性状更有利于获取DNA，也许是低温使 有利于高效转化的生长时相延长了。 • 在18 0C进行细菌培养并非易事，大多数实验室都没有这种摇床。将摇床 臵于4 0C冷室，用温控器加温至18 0C是一个解决问题的方法。也可使培 养物的温度维持在20－23 0C，这样做并不会造成转化效率降低。这一温 度在很多实验室其实是室温。在这一温度范围，细菌生长得很慢，倍增 时间大约为2.5-4h。如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是在晚 间较迟的时侯，这时细菌的OD600 吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。 解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。
SOC 培养基的配制
• • • • • • SOB培养基的配制: 配制每升培养基,在950 ml 去离子水中加入： 胰化蛋白胨（tryptone）20 g 酵母提取物 5g NaCl 0.5g 摇动容器使溶质完全溶解。加10 ml 250 mM KCl 溶液（将1.86g KCl用100 ml 去离子水溶解即配成250 mM KCl溶液）。用5 M NaOH调pH值至7.0。用去离子水 定容至1L。在15 psi（1.05kg/cm2）高压下蒸汽灭菌20 min. 该溶液在使用前， 加入 5 ml灭菌的2 M MgCl2 [2 M MgCl2 溶液的配制方法如下：用90ml去离子水 溶解19 g MgCl2, 用去离子水调整体积为100 ml,在15 psi(1.05kg/cm2)高压下 蒸汽灭菌20 min]。 SOC培养基： SOC培养基除含有 20 mM葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经高 压灭菌后冷至60C或60C以下，加20ml除菌的1 M葡萄糖溶液（1M 葡萄糖溶液 的配制方法是： 用90 ml 去离子水溶解18 g葡萄糖，完全溶解后， 用去离子水 定容至100 ml，用0.22 m滤器过滤除菌）。 SOC培养基极易染菌，所以配好后一定要分装成小份，每次取一份使用，其余放 4°C保存。
Preparation of Calcium-competent Bacteria Cells
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Put 2 ml of O/N bacteria culture into 200 ml LB（tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%, pH7.0） Incubate at 370C until OD550=0.5 Chill on ice-water bath, swirl Spin at 5,000rpm for 10 min Re-suspend in 100 ml ice-cold Mg++ solution (100mm MgCl2/10mM Tris.Cl, pH7.5) On ice-water bath for 5 min Spin at 4,000rpm for 10 min Re-suspended in 100 ml of ice-cold Ca++ solution (100 mM CaCl2/10 mM Tris.Cl, pH 7.5) On ice-water bath for 20 min Spin at 4000rpm for 10 min Re-suspend in 10 ml Ca/Glycerol (8.5 ml Ca++ solution/1.5ml glycerol) Aliquot to 200 ul/tube, store at -700C freezer
Calcium-mediated Transformation of Bacteria
• To 50-100 ul competent bacteria cells add 1-5 ul of DNA ligation reaction or plasmid DNA, mix by tapping gently • Stand on ice for 30 min • Put into 420C water bath for 30 sec. • Add 250 ul to 500 ul of pre-warmed SOC (or LB) • • Shake the vials or tubes at 370C for 45 min to 1 hour at 225 rpm • • Spread 20 ul to 200 ul transformed bacteria onto bacteria agar plates (you may also dilute the bacteria before spreading) • Invert plates, and put into incubater at 370C, over night.
分子生物学与生物化学实验 操作、设计与技能
转化技术(一)
李刚 副教授
contents
1
细菌转化技术
2
酵母转化技术
细菌转化技术
• 一、化学转化法； • CaCl2转化法、CaCl2-MgCl2转化法、 Hanahan方法、Inoue方法等；
• 二、物理转化法： 电击转化法、基因枪转化法等；超声波转 化法、激光转化法等；
Hanahan方法获得高转化效率的关键因素
• 1、使用高纯度的水和二甲基亚砜，实验过 程中尽可能使用新买的试剂和培养基。 • 2、细菌的生长状态。接种的细菌应用直接 取自冻存于-70℃的储备菌中直接培养获得。 而不能使用在实验室中连续传代或存放于4 ℃或室温的培养物。 • 3、试验中所使用的玻璃和塑料器皿应清洗 干净，并用超纯水充满，再经高温高压消 毒。