遗传学(笔记)21-25

○原核染色体是褐露的DNA，染色质结构对基因的表达没有明显的调控。真核的染色质DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体，染色质结构对基因的调控是明显的。

○原核生物中有正调控（乳糖操纵子）和负调控。真核生物迄今已知的主要是正调控，而且一个真核基因通常都有多个调控序列，必须有多个激活物同时特异地结合去才能启动基因的转录。

○原核生物：转录和翻译的在同一地点同时进行的。

真核生物：转录在细胞核中进行，翻译在胞质中进行。

○真核生物：多细胞，不同细胞表达不一样。

原核生物：单细胞。

遗传工程

所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合。然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞，使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程也称为遗传工程、基因操作、ＤＮＡ重组技术。有时人们还称它为基因克隆或分子克隆。

遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备，载体的选择，体外ＤＮＡ重组，重组ＤＮＡ引入受体细胞，克隆转化子的筛选，重组ＤＮＡ的检测等。

第一节基因工程的酶学基础

一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：

这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。限制性内切酶本来是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。

根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：

Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。

Ⅱ型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。

•识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。

•许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。

Ⅲ型酶：这类酶可识别特定顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp 处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。

同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂、酶对甲基化位点的敏感性不同。

同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。

★限制性核酸内切酶的命名原则：

第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。

第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个

字母。

其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。

罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。

例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。

二、末端转移酶（terminal transferase）

该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶，它所催化的反应与DNA pol

I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮ

Ａ片段为引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。

平末端的另一种处理方式是利用衔接物进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。

如： CCGGATCCGG

GGCCTAGGCC

将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。

这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。

三、ＤＮＡ连接酶（DNA ligase）

该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。

DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连

接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。

四、反转录酶（reverse transcriptase）

这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。

五、S1核酸酶：

来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。

第二节基因工程载体

载体是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：•分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。

•能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。

•要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。

•有适合的标记，易于选择。

•有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。

•从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。

质粒载体：

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质粒是一种独立于染色体外的小分子环状ＤＮＡ，一般大小约106~108D ，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。 植物基因工程载体：

用于植物基因工程的载体有Ti 质粒载体及病毒载体两类。 Ti 质粒是存在于根癌农杆菌的一种质粒。根癌农杆菌感染植物时，会在植株的根——茎结合部产生未分化的细胞团，即冠瘿瘤。有意思的是在形成冠瘿瘤的同时，一部分Ti 质粒（T DNA ）可以重组到植物染色体中去，这一特性使Ti 质粒有希望成为有效的植物基因工程载体，事实上，Ti 质粒是迄今研究得最多的植物基因工程载体。

哺乳动物基因工程载体：

目前使用的哺乳动物基因载体大多由哺乳动物病毒经改造而成。用得比较多的病毒有猴空泡病毒（SV40）、单纯疱疹病毒（HSV ）、Rous 肉瘤病毒、EB 病毒等。 ◆新霉素抗性选择系统：

新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo ）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo 基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。 ◆氯霉素乙酰转移霉检测系统： 氯霉素乙酰转移霉（CAT ）可使氯霉素乙酰化而失去活性。当cat 基因在真核细胞内表达后，制备细胞提取物，然后加入乙酰辅酶A 及14C 标记的氯霉素，如果细胞中存在cat ，可使氯霉素乙酰化，通过薄层层析将乙酰化及未乙酰化的氯霉素分开，再用放射自显影检测。

第三节 基因工程的应用

一、基础理论研究：

• 基因的结构与功能。 • 基因的人工定点突变。 • 人类基因组计划

二、医学领域中的应用：

•

疾病的诊断：包括遗传性疾病与传染性疾病。使用的技术主要有PCR 技术、RFLP 用于ELISA 技术的基因工程抗原、产前诊断等。

• 疾病的预防：基因工程 疫苗。

•

疾病的治疗：基因工程药物、基因治疗。

基因治疗：指利用遗传学的原理治疗人类的疾病。目前人类基因治疗主要集中在遗传性疾病、肿瘤及某些传染性疾病。至1997年初，全世界共记录了2103例基因治疗病例（美国1700例）。其中68%是治疗肿瘤的，19%是治疗遗传病的，12%治疗传染性疾病等。 第一例基因治疗的疾病是1990年9月每个FDA 批准的用ada （腺苷脱氨酶）基因治疗SCID （严重型联合型免疫缺陷症。第一例接受治疗的是一位4岁的女孩，第二例是一位9岁的女孩。

我国在遗传病的基因治疗方面也开展地比较早。1991年7月，

我国开始进行HEMB （血友病B ，凝血因子IX 突变）的基因治疗。从一批志愿接受基因治疗的HEMB 患者中选择了两兄弟（伴性遗传）进行治疗。效果明显，1994年通过卫生部的评审。

三、其它领域的应用 农作物：

主要在抗病虫害、抗逆性、提高品质等方面的转基因作物。至1998年4月，世界各国批准进行的大田实验已达4387项。 畜牧业：

培养出了包括猪、牛、羊、马、鸡、鱼等多种动物的转基因动物，涉及的基因有生长激素基因、抗冻基因、抗病毒基因等。