氨基酸含量的测定-茚三酮比色法

（2）标准曲线的绘制
管号 氨基酸标准溶液 /mL 水/mL 1 0 1.6 2 0.5 1.1 0.4 0.4 3 0.6 1.0 0.4 0.4 4 0.7 0.9 0.4 0.4 5 0.8 0.8 0.4 0.4 6 0.9 0.7 0.4 0.4 7 1.0 0.6 0.4 0.4 200
（3）样品测定
管号 8 9 10 11
样品溶液/mL
水/mL 磷酸盐缓冲液/mL 茚三酮/mL
0
1.6 0.4 0.4
0.5
1.1 0.4 0.4
0.5
1.1 0.4 0.4
0.5
1.1 0.4 0.4
按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行 实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标 准曲线上查出氨基酸含量微克数。
实验九 氨基酸含量的测定 （茚三酮比色法）
1. 实验原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、
氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三
酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在
570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基 酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
2. 实验材料、仪器与试剂
材料：酱油
仪器：可见分光光度计，分析天平，容量
瓶，移液管，具塞刻度试管。
试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、
磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
3. 实验步骤
（1）样品的处理：准确吸取0.5mL酱油于100mL
烧杯中，加入5g活性炭和50mL蒸馏水，置于80℃ 水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣 清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至 刻线，摇匀备用。
磷酸盐缓冲液/mL 0.4 0.4 茚三酮/mL 氨基酸含量/μg 0
100 120Biblioteka Baidu
140 160 180
各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至室 温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光度，
以氨基酸含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
4. 结果计算
5. 说明及注意事项
（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可
达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。 （2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色， 最大吸收波长在440nm处。
（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎 后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL， 置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭， 加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性 炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线，
摇匀备用。
6. 思考题 （1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？ （2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点 各是什么？