细胞生物学技术：7流式细胞术---原理、操作及应用
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散 射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
（三）散射光的作用
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的 细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
BD公司分析型流式细胞仪
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
标记抗体的荧光素
激发光波长 发射光波长
（nm）
（nm）
490
520
488
575
490
675
650
660
496/546
670
496/546
7中文名
异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
核酸荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响； PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
1.3 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统
• 光学系统
– 激发光源 – 光束收集系统
流式细胞仪的分类
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； – 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流
式细胞仪一般只用于分选。
流式细胞仪的发展及商品化
• 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； • 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； • 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； • 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； • 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； • 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； • 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； • 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱 基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链 上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想 的DNA定量染料。
流式细胞术
---原理、操作及应用
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– 流式细胞术简介 – 流式细胞仪的光信号检测 – 流式细胞仪的结构组成 – 荧光抗体的选择 – 流式细胞术数据的存贮、显示与分析
• 二、流式细胞术操作与技巧 • 三、流式细胞术在生物医学中的应用
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
• 荧光信号
– 自发荧光 (细胞色素因子、核黄素)： 微弱
– 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
1.2.1 散射光信号
（一）前向散射光FSC
FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内， 亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。
（二）侧向散射光SSC
（二）常用荧光素
<499nm 蓝色荧光（Blue）；
500-549nm，绿色荧光（Green）；
550-584nm，黄色荧光（Yellow）； 585-615nm，橙色荧光（Orange）；
616-700nm，红色荧光（Red）； ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。
荧光素分子
FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647
死细胞 或碎片
粘连 细胞
死细胞
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
1.2.2 荧光信号
（一）荧光： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变
为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
激发波长
＜
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
FACS Verse双激光六色，三 激光八色
BD公司分选型流式细胞仪
FACSVantage SE FACSAria III
Influx
1.2 流式细胞术光信号检测
光信号的类型
• 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
（三）散射光的作用
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的 细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
BD公司分析型流式细胞仪
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
标记抗体的荧光素
激发光波长 发射光波长
（nm）
（nm）
490
520
488
575
490
675
650
660
496/546
670
496/546
7中文名
异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
核酸荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响； PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
1.3 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统
• 光学系统
– 激发光源 – 光束收集系统
流式细胞仪的分类
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； – 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流
式细胞仪一般只用于分选。
流式细胞仪的发展及商品化
• 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； • 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； • 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； • 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； • 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； • 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； • 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； • 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱 基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链 上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想 的DNA定量染料。
流式细胞术
---原理、操作及应用
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– 流式细胞术简介 – 流式细胞仪的光信号检测 – 流式细胞仪的结构组成 – 荧光抗体的选择 – 流式细胞术数据的存贮、显示与分析
• 二、流式细胞术操作与技巧 • 三、流式细胞术在生物医学中的应用
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
• 荧光信号
– 自发荧光 (细胞色素因子、核黄素)： 微弱
– 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
1.2.1 散射光信号
（一）前向散射光FSC
FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内， 亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。
（二）侧向散射光SSC
（二）常用荧光素
<499nm 蓝色荧光（Blue）；
500-549nm，绿色荧光（Green）；
550-584nm，黄色荧光（Yellow）； 585-615nm，橙色荧光（Orange）；
616-700nm，红色荧光（Red）； ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。
荧光素分子
FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647
死细胞 或碎片
粘连 细胞
死细胞
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
1.2.2 荧光信号
（一）荧光： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变
为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
激发波长
＜
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
FACS Verse双激光六色，三 激光八色
BD公司分选型流式细胞仪
FACSVantage SE FACSAria III
Influx
1.2 流式细胞术光信号检测
光信号的类型
• 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).