《分子生物学》实验报告-植物基因组DNA的提取及其定性定量分析

《分子生物学》实验报告

实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析

【实验目的】

通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。

【实验原理】

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。

核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL，ssDNA 33 μg/mL和ssRNA 40 μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm

的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

【仪器、材料与试剂】

一、仪器及耗材

离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL 量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、

1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。

二、药品

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。

三、试剂

1. 2×CTAB buffer【1】

2.70%乙醇【2】

3.RNaseA (天根)【3】

4.0.5×TBE缓冲液(工作浓度)【4】

5.6×loading buffer【5】

6. 核酸染料(赛百盛)

7. DNA marker DL 2000(Takara)

8. 酚/氯仿(1:1, V/V) 【6】

【实验步骤】

1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 mL EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。

2. 加入0.6 mL 2×CTAB提取液（用前加入0.2﹪的巯基乙醇），混匀，65℃水浴30 min，

每10 min颠倒混匀一次。

3. 取出离心管，冷却后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混匀。

4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次)。

5. 将上清液(约400 μL)转移到另一新的1.5 mL离心管中。

6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350μL)。

7. 加入600 μL无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30 min。

8. 4℃，15,800 rpm离心20 min，弃上清。

9. 1 mL 70％乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干。

10. 加入30 μL无菌水(含20 μg/mL RNase A)，37℃溶解DNA 30 min。

11. 取5 μL DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：

(1) 制备琼脂糖凝胶

称取0.3 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL 0.5× TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。

(2) 胶板的制备

①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。

②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。

③待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时，加入核酸染料1.5 μL，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

④室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。

⑤加入0.5× TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1 mm。

(3) 加样

在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。

(4) 电泳

①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm。

②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

③紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。

12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度：