第二章 分子克隆工具酶题目

第二章分子克隆工具酶
一、选择题
1.有关基因工程的叙述正确的是（）
A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用
B.重组质粒的形成在细胞内完成
C.质粒都可作运载体
D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
2.限制性内切酶EcoRⅠ在野生型的λ噬菌体DNA中有5个切点，Hind Ⅲ有7个切点。

调
整这些酶切位点的数量，主要通过（）。

A.体内突变
B.完全酶切后连接
C.部分酶切
D.先用甲基化酶修饰后再酶切
二、填空题
1.如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5‟突出的黏性末端，则可以用__________进行3‟末端标记。

如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3‟突出的黏性末端，可以用__________________ 进行3‟末端标记。

2.可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有____________和_______的活性。

三、判断题
1. pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段。

pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。

同时pBR327具有接合能力，能直接转入其他细胞（）
四、名词解释
1. DNA聚合酶
2. 限制性内切酶
3. 甲基化酶
4. T4-DNA连接酶
5. 核酸酶
6. Klenow酶
7. T4 DNA聚合酶
8. Taq DNA聚合酶
9. 逆转录酶10. 同裂酶
11. 核酶
五、简答题
1.限制性内切酶分为哪几大类，各有什么特点？
2. DNA修饰酶主要有哪些，各有什么作用？
3.简述Klenow聚合酶的用途。

4.比较E.coli DNA 连接酶和Taq DNA 连接酶的作用特点。

5.限制性内切酶I 的识别序列和切点是——GATCC G ↓，限制性内切酶II 的识别序列和切点是——GATC ↓。

在质粒上有酶I 的1个切点，在目的基因的两侧各有l 个酶II 的切点。

用上述两种酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA 。

（1）请画出质粒被限制酶I 切割后所形成的黏性末端。

（2）请画出目的基因两侧被限制酶II 切割后所形成的黏性末端。

（3）在DNA 连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？
六、问答题
1. 同裂酶与同尾酶有何区别?
2. 什么是DNA 聚合酶，DNA 聚合酶I 有哪些生物活性？
3. 分别说出核生物和真核生物的DNA 聚合酶的作用与功能。

4. 分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？
答案
一、选择题
1.C
2.A
二、填空
1. Klenow 酶填补的方法；T4DNA 聚合酶
2. 5‟?3‟合成酶；3‟ ?5‟外切核酸酶
三、判断1 对
四、名词解析
1. DNA 聚合酶： DNA 聚合酶（DNA polymerase ）的主要活性是催化DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。

2.限制性内切酶：是能特异性识别并在专一位点上切割外源DNA 的核酸内切酶，由于自身的染色体DNA 被甲基化酶甲基化而不被切割。

3.甲基化酶：真核和原核生物存在大量的甲基化酶，原核生物的甲基化酶作为限制与修饰系统中的一员，用与保护宿主DNA 不被相应的限制酶切割。

4. T4-DNA 连接酶：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3'端羟基和5'端磷酸基因，脱水形成3'-5'磷酸二酯键连接双链DNA 上的单链缺口（Nick ），因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端 ，连接RNA 模板上的DNA 链缺口，连接平头双链DNA 速度很慢，
在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，这属于分子之间的连接。

5.核酸酶：是降解磷酸二酯键，分为RNA核酸酶和DNA核酸酶，不同的核酸酶还分为内切酶和外切酶。

6 . Klenow酶：是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去具5＇→3＇外切酶活性的肽段后的大片段肽段，具有聚合活性和3＇→5＇外切核酸酶活性。

用途：补平DNA的3＇凹端，抹平DNA的3＇凸端，通过置换反应对DNA进行末端标记，随机引物标记等。

7. T4 DNA聚合酶：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，噬菌体感染的大肠杆菌，活性与klenowDNA聚合酶的活性相似，但3＇→5＇外切核酸酶活性强200倍，且不从单链DNA 模板上替换引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高1倍。

8. Taq DNA聚合酶：指在高温下具有活性的DNA聚合酶。

主要用于PCR反应。

9．逆转录酶：即依赖于RNA的DNA聚合酶，有5＇→3＇合成DNA活性，但无3＇→5＇外切核酸酶活性。

主要用于cDNA克隆中第一链的合成，5＇突出DNA的补平和标记，双脱氧终止法测序（当用DNA聚合酶Ⅰ和klenowDNA聚合酶不理想时用），以及其他用途如RT-PCR或是测RNA二级结。

10．同裂酶：一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。

同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。

11．核酶:核酶具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。

五、简答题
1.答:限制性内切酶分为三大类，各自己的特点如下：
I类能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。

II类识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断
III类识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。

因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。

2.答:DNA修饰酶主要有以下几种：
（1）碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5’端的磷酸基团。

（2）polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。

（3）末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase）来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。

（4）Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构
3. 用途：
（1）补平3…凹端DNA 。

使用单纯的DNA 合成活性。

注意要加足够的dNTP ；如果使用带标记的dNTP ，则可对DNA 进行末端标记。

（2）抹平DNA 3' 凸端。

在3'--5' 外切活性作用下，可切除突出的3' 凸端。

注意必须加足量dNTP ，否则外切活性不会停止。

但由于T4 和T7 DNA 聚合酶具更强的3'--5' 外切活性，现在已经取代了Klenow DNA 聚合酶的这一作用。

（3）通过置换反应对DNA 进行末端标记。

但是该作用也已经被T4 或T7 DNA 聚合酶代替；它还可以在补平3…凹端的过程中进行标记。

（4）在cDNA 克隆中合成第二链。

（5）随机引物标记。

（6）应用于Sanger 双脱氧链末端终止法的DNA 测序（已经被T7 DNA 聚合酶取代）。

（7）应用于PCR 反应，现在已经被Taq DNA 聚合酶等取代。

（8）在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA 。

4.答：E.coli DNA 连接酶：与T4 DNA ligase 活性相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）参与，常用于置换合成法合成cDNA 。

作cDNA 克隆时，不会将RNA 连接到DNA ，不连接RNA 。

可用于Okayama and Berg 法克隆cDNA 。

Taq DNA 连接酶：具有在两个寡核苷酸之间进行连接反应的活性，可用于检测等位基因的变化以及在PCR 扩增中引入寡核苷酸。

同时必须与另一DNA 链形成杂交体，相当于连接dsDNA 中的缺口，作用在45℃～65℃，需NAD+。

它不可替代T4 DNA ligase 。

5.（1）
切割
酶I
GGATCC
—
—G
——
GATCC
—
—CCATGG CCTAG
——
G
（2）
（3）可以连接，因为由两种限制性内切酶切割后形成的黏性末端是相同的（或答可以互补配对）。

六、问答题
1.答案：同裂酶(isoschizomer)：是来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。

同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端.具体可分为以下几种情况：
①同序同切这些酶识别序列和切割位置都相同。

如：HindII 与HincII 识别切割位点为GTY/RAC;
HpaII与HapII 识别切割位点为C/CGG;
MobI 与Sau3AI 识别切割位点为/GATC。

②同序异切这些酶识别序列相同，但切割位点不同。

如：KpnI识别和切割位点为GGTAC/C, Acc65I识别和切割位点为
G/GTACC ,Asp718I识别和切割位点为G/GTACC;AatII 识别和切割位点为
GACGT/C，BsaHI识别和切割位点为GR/CGYC。

③“同功多位” 许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。

如：EcoRI 识别和切割位点为G/AATTC，ApoI识别和切割位点为R/AATTY后者可识别前者的序列；HpaI和HincII的识别位点也有交叉，他们的识别和切割位点
分别为GTT/AAC和GTY/RAC。

④其它有些限制酶识别的序列有交叉。

如：在pUC系列质粒的多克隆位点中有一个SalI 位点（识别和切割位点为G/TCGAC），该位点可被AccI（识别和切割位点为GT/MKAC）和HincII（识
别和切割位点为GTY/RAC）切割。

同尾酶：
只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同，但基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。

这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端。

由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。

如XbaI、NheI、SpeI以及StyI切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。

还有以下几种酶产生的末端是相同的。

EcoRI的识别和切割位点为G/AATTC ，MfeI 的识别和切割位点为C/AA TTG，ApoI的识别和切割位点为R/AA TTY。

2. 答：DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备摸板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。

DNA聚合酶I的活性如下：5’-3’聚合酶活性，3’-5’外切酶活性，5’-3’外切酶活性。

DNA聚合酶与Klenow酶的区别是DNA聚合酶有5'-3'外切活性而Klenow酶无。

DNA 聚合酶利具有5'-3'外切核酸酶活性，可用切口平移法标记DNA。

但Klenow酶因为没有5'-3'外切核酸酶活性是其利用范围进一步扩大。

例如：补平DNA的3＇凹端，抹平DNA的3＇凸端，通过置换反应对DNA进行末端标记，随机引物标记等。

3.答：DNA聚合酶（DNA polymerase）的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。

DNA聚合酶的共同特点是：
（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5'→3'（4）除聚合DNA外还有其它功能。

所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性，都可以在3'－OH上加核苷酸使链延伸，其速率为1000 Nt/min。

加什么核苷酸是根据和模板链上的碱基互补的原则而定的。

其中真核细胞有四种DNA聚合酶：
DNA聚合酶α位于细胞核内，有催化细胞增生的作用；
DNA聚合酶β位于细胞核内，有修复DNA的作用；
DNA聚合酶γ位于线粒体内，是线粒体DNA合成酶和具有3＇→5＇外切酶活性。

DNA聚合酶δ位于细胞核内，有持续合成DNA链的能力和3＇→5＇外切酶活性，是完成复制的主要酶；DNA聚合酶ε位于细胞核内，参与DNA的修复合成和具有3＇→5＇外切酶活性。

原核细胞有三种DNA聚合酶：
DNA聚合酶Ⅰ具有切除引物与修复DNA功能和3＇→5＇外切酶活性与5＇→3＇外切酶活性，用于切口平移法中标记DNA、cDNA克隆中的第二链合成和对3＇-突出末端的DNA作末端标记；
DNA聚合酶Ⅱ具有修复DNA功能和3＇→5＇外切酶活性；
DNA聚合酶Ⅲ是DNA复制酶和具有3＇→5＇外切酶活性。

用途：（1）缺口平移法制作标记DNA，可用作杂交探针；
（2）合成cDNA的第二链，即单纯的DNA聚合活性；
（3）填补双链DNA3‟凹端；
（4）DNA序列分析
3.答：（1）、常用的工具酶
①限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺
序的核酸水解酶。

②DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。

③DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。

④逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA 成为
DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。

⑤末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3＇末端。

⑥碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5＇磷酸基团。

⑦依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。

（2）、良好载体的条件
①必须有自身的复制子；
②载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；
③载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；
④载体分子必须有足够的容量；
⑤可通过特定的方法导入细胞；
⑥对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。