免疫学检测技术及应用
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免疫学检测技 术及应用
免疫学检测技术应用：
1. 疾病的诊断、治疗效果评价及发病 机理探讨：
如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏 反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排 斥反应、肿瘤等
2. 免疫分子的定性、定量测定：
如：细胞因子、粘附分子、细胞受体 、补体、抗体等
3. 抗原物质的定性、定量检测： 如：病原微生物及其代谢产物，组织细
胞、蛋白质等 4. 免疫细胞的分离、鉴定及功能测定：
如：T细胞及其亚群等
抗原－抗体反应
抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生 特异性结合，呈现的某种反应现象。
抗原抗体反应有以下几个特点:
1.抗原与抗体结合是特异性结合 表位(抗原)——超变区(抗体)
2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合 氢键、疏水键、静电引力和范德华力
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
特异性强 应用：微量抗原和抗体检测。 缺点：不稳定，废物处理麻烦等。
（四）发光免疫分析(luminescent immunoassay, LIA)
原理：用发光物质标记抗体(或抗原),再同 抗原(或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原 抗体反应的指示系统。
2.酶免疫测定
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
原理：①将抗原(或抗体)结合于固相载体； ②与抗体(或抗原)反应；③加酶底物，酶促反 应。
灵敏度：2X10-5 μg／ml 应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微 生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等） 。
1.免疫酶染色(又称免疫组化技术, immunohistochemistry technique)
原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶等) 标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗体 与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶 标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生 有色物质，观察结果。
应用：细胞内、组织内抗原的定性、 定量和定位检测。
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
test)
三.免疫标记技术
用荧光素、同位素、酶及发光等示踪物 质标记抗体(或抗原)，与抗原(或抗体)进行反 应，通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗 体)的存在或含量的方法。
灵敏度：高，1X10-4 ～1X10-5ug抗体/ml 应用：微量物质的定性、定量或定位。
免疫标记技术的基本类型：
（一）免疫荧光技术(immunofluorescence
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
ຫໍສະໝຸດ Baidu
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
凝集反应包括：
◆ 直接凝集反应 (direct agglutination) ◆ 间接(被动)凝集反应(indirect/passive
agglutination) ◆ 间接凝集抑制试验(indirect agglutination
inhibition test) ◆ 协同凝集试验(coagglutination test) ◆ 抗球蛋白试验(antiglobulin test，Coomb’s
检测未知抗原； 检测未知抗体。
Sensitivity of varior immunoassays
一、沉淀反应(precipitation)
可溶性抗原与相应抗体在电解质存在 条件下结合，出现沉淀物的现象。
沉淀反应的试验方法：环状法 絮状法 琼脂中沉淀法
琼脂中沉淀反应法：
• 双向免疫扩散(double immunodiffusion) • 单向免疫扩散(single radial
immunodiffusion) • 对流免疫电泳(counter
immunoelectrophoresis) • 火箭电泳(rocket electrophoresis) • 免疫电泳(immunoelectrophoresis)
二、凝集反应(agglutination)
颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗 原(或抗体)于相应抗体(或抗原)，在电解质 存在下出现凝集物的现象。
(Van der waal‘s force) 、电子云力的合 力。
抗原和抗体可解离,性质不变。
3.抗原抗体反应可分为两个阶段 （1）特异性结合阶段
此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无可见 反应出现 （2）可见反应阶段
需时较长,数分,数小时或数日出现可见现 象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等 4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现 象,与两者的分子比例密切相关
technique) （二）免疫酶技术(immunoenzymatic
technique) （三）同位素标记技术(isotope labelling
technique) （四）发光免疫测定(luminescent immuno-
assay, LIA) （五）免疫胶体金标记技术(colloidal gold
抗原抗体反应的主要影响因素：
1.电解质:
在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电 荷,•适当浓度的电解质会使它们失去一部 分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝 集现象。
2.温度:
37℃
3. 酸碱度:
pH6-8
抗原抗体反应包括：
沉淀反应 凝集反应 溶解反应 补体结合反应 中和反应
已知抗体 已知抗原
免疫学检测技术应用：
1. 疾病的诊断、治疗效果评价及发病 机理探讨：
如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏 反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排 斥反应、肿瘤等
2. 免疫分子的定性、定量测定：
如：细胞因子、粘附分子、细胞受体 、补体、抗体等
3. 抗原物质的定性、定量检测： 如：病原微生物及其代谢产物，组织细
胞、蛋白质等 4. 免疫细胞的分离、鉴定及功能测定：
如：T细胞及其亚群等
抗原－抗体反应
抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生 特异性结合，呈现的某种反应现象。
抗原抗体反应有以下几个特点:
1.抗原与抗体结合是特异性结合 表位(抗原)——超变区(抗体)
2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合 氢键、疏水键、静电引力和范德华力
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
特异性强 应用：微量抗原和抗体检测。 缺点：不稳定，废物处理麻烦等。
（四）发光免疫分析(luminescent immunoassay, LIA)
原理：用发光物质标记抗体(或抗原),再同 抗原(或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原 抗体反应的指示系统。
2.酶免疫测定
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
原理：①将抗原(或抗体)结合于固相载体； ②与抗体(或抗原)反应；③加酶底物，酶促反 应。
灵敏度：2X10-5 μg／ml 应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微 生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等） 。
1.免疫酶染色(又称免疫组化技术, immunohistochemistry technique)
原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶等) 标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗体 与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶 标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生 有色物质，观察结果。
应用：细胞内、组织内抗原的定性、 定量和定位检测。
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
test)
三.免疫标记技术
用荧光素、同位素、酶及发光等示踪物 质标记抗体(或抗原)，与抗原(或抗体)进行反 应，通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗 体)的存在或含量的方法。
灵敏度：高，1X10-4 ～1X10-5ug抗体/ml 应用：微量物质的定性、定量或定位。
免疫标记技术的基本类型：
（一）免疫荧光技术(immunofluorescence
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
ຫໍສະໝຸດ Baidu
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
凝集反应包括：
◆ 直接凝集反应 (direct agglutination) ◆ 间接(被动)凝集反应(indirect/passive
agglutination) ◆ 间接凝集抑制试验(indirect agglutination
inhibition test) ◆ 协同凝集试验(coagglutination test) ◆ 抗球蛋白试验(antiglobulin test，Coomb’s
检测未知抗原； 检测未知抗体。
Sensitivity of varior immunoassays
一、沉淀反应(precipitation)
可溶性抗原与相应抗体在电解质存在 条件下结合，出现沉淀物的现象。
沉淀反应的试验方法：环状法 絮状法 琼脂中沉淀法
琼脂中沉淀反应法：
• 双向免疫扩散(double immunodiffusion) • 单向免疫扩散(single radial
immunodiffusion) • 对流免疫电泳(counter
immunoelectrophoresis) • 火箭电泳(rocket electrophoresis) • 免疫电泳(immunoelectrophoresis)
二、凝集反应(agglutination)
颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗 原(或抗体)于相应抗体(或抗原)，在电解质 存在下出现凝集物的现象。
(Van der waal‘s force) 、电子云力的合 力。
抗原和抗体可解离,性质不变。
3.抗原抗体反应可分为两个阶段 （1）特异性结合阶段
此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无可见 反应出现 （2）可见反应阶段
需时较长,数分,数小时或数日出现可见现 象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等 4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现 象,与两者的分子比例密切相关
technique) （二）免疫酶技术(immunoenzymatic
technique) （三）同位素标记技术(isotope labelling
technique) （四）发光免疫测定(luminescent immuno-
assay, LIA) （五）免疫胶体金标记技术(colloidal gold
抗原抗体反应的主要影响因素：
1.电解质:
在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电 荷,•适当浓度的电解质会使它们失去一部 分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝 集现象。
2.温度:
37℃
3. 酸碱度:
pH6-8
抗原抗体反应包括：
沉淀反应 凝集反应 溶解反应 补体结合反应 中和反应
已知抗体 已知抗原