聚合酶链反应

核酸扩增

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)由美国Centus公司的Kary Mullis发明，于1985年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检

疫中用于微量样品的检测。

1. PCR的基本原理和过程PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合(退火)、引物延伸合成 DNA这三步构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板 DNA。这样，目的的DNA的数量将以2n -2n的形式累积，在2小时内可扩增30(n)个循环， DNA量达原来的上百万倍。PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物和Mg2+ 存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链的延伸反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、

Southern杂交或DNA序列分析进行检测。

反应条件和反应系统的组成

(1) 反应条件PCR反应通过三种温度的交替循环来进行，一般94℃变性30秒，55℃退火 30秒，70-72℃延伸30-60秒，依此条件进行30次左右的循环。(2) PCR反应系统的组成标准的PCR反应体系一般选用50-100μl体积，其中含有：50mmol/L KCl，10mmol/L (室温，，L MgCl2明胶或牛血清白蛋白(BSA)，2种引物，各(mol/L，4种脱氧核糖核苷酸底物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)各200( mol/L，模板 DNA (g，TaqDNA聚合酶。

基本操作一个典型的PCR反应可按以下步骤进行:

(2) 置94℃加热5分钟；

(3) 将μl Taq DNA聚合酶(5iu/μl)加入反应混合液中；

(4) 将100μl轻矿物油加入混合液表面，以防水分蒸发；

(5) 按所设定的反应条件进行循环反应（在PCR仪上进行）；

(6) 反应终止后，取样品进行凝胶电泳，Southern杂交或DNA序列分析以鉴定是否得到特异的扩增产物。

衍生技术PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR 以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR外，尚有不对称PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫PCR和套式PCR等。

(1) 反转录PCR(reverse transcription PCR，RT－PCR) RT－PCR用于扩增RNA 样品。在PCR体系中先引入反转录酶，将RNA反转录获得cDNA，再以cDNA做为PCR的模板，加入引物和Taq DNA聚合酶按正常PCR方式扩增 cDNA。这一技术广泛应用于RNA和RNA病毒的检测。

(2) 锚定PCR(Anchored PCR) 通常进行的PCR试验必须知道欲扩增DNA或RNA 片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行PCR。当欲扩增的片段序列未知时，可通过锚定PCR进行扩增。其基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA 3’端加上同源多聚物poly(dG)尾，通过与其互补的锚定引物poly(dC)来保证扩增反应的特异性。

(3) 反向PCR(Inverse PCR) 常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段，反向PCR则用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段环化，再用限制性内切酶切开已知序列，这样线性化后原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列之间，再经常规PCR操作就可大量扩增未知序列。

(4) 不对称PCR(Asymmetric PCR) 不对称PCR又称单链扩增PCR。一般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PCR中，两种引物的量相差悬殊，一般为50:1-100:1，这样在生成一定数量的双链产物后，较少的引物就会被用完，大量生成一条单链的DNA，分离单链即可直接进行序列分析等研究。

(5) 多重PCR(Multiplex PCR) 应用PCR技术可检测特定序列的存在或缺失。某些疾病的基因片段较长，且常有多处发生缺失或突变，用一对引物进行PCR 检测时，扩增不到目的片段，此时就须使用多重PCR技术。在同一反应管中加入多对引物，扩增同一模板的多个区域。如果某一片段缺失，或扩增该片段的引物与被检核酸同源性太低，则在相应的电泳图谱上就无相应的正常片段出现，但可保证其他特异片段出现。目前报道的多重PCR反应，最多可同时扩增12条区带。当然，也可设计两对引物，分两次进行常规PCR。

(6) 着色互补PCR(Colour complementation assay) 着色互补PCR又称荧光PCR(Fluroscent PCR)。其原理是用不同的荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引物，通过多重PCR同时扩增多个DNA片段。反应结束后除去多余引物，扩增产物在紫外线照射下能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。通过颜色的有无及其组合可很快诊断基因的缺失、有较大变异或发现某些感染的病毒基因等。这一技术为PCR技术的临诊自动化诊断打下了基础。

(7) 免疫PCR 免疫PCR即免疫多聚酶链反应(Immuno－PCR)，它是将高度灵敏的PCR技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型的诊断技术，是目前最有希望的诊断方法。它的原理是通过应用一个对DNA和抗体具有双重结合活性的联接分子使二者联接起来，这样就可以使作为指示系统的DNA分子通过抗体而特异性地结合到抗原上，从而形成一种特异性“抗原－抗体－DNA复合物”，再通过对其中已知片段DNA的PCR扩增，即可证明抗原存在与否。这种方法的特点在于：① 通过免疫捕获作用纯化检测对象；② 用于检测的微生物无需事先明确其核酸序列；③ 该方法也适用于微生物以外的抗原检测，其前提条件是被检测对象具有良好的抗原性，并且备有其相对应的抗体；④ 无需根据不同对象设计不同的引