糖基化去除大豆球蛋白免疫原性方法的优化

采用的干粉反应
的方法， 采用间接竞争酶联免
疫吸附 试 验 （ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ ） 方 法 绘 制 出 标 准 曲 线， 获得 理想蛋白质 浓 度 的 反 应 区 间， 进而确定样品的制 样浓度。将已知浓 度 的 大 豆 球 蛋 白 纯 化 抗 原 （ 参
１ １ ］ 照Ｓ ｅ ｔ ｓ ｕ ｋ ｏ 等［ 的免疫法实验室自制， 采用琼脂糖
［ １ ３ ］ ［ １ ２ ］
７℃ 下孵育（ 湿盒） １ｈ 。重复上 液配制） ， 然后在 ３ 目的是洗去过量的牛血清 次洗板过程， 洗板 ３次（ 白蛋白） ， 拍干后加入梯度稀释好的大豆球蛋白标 准液 （ 取 纯 化 的 大 豆 球 蛋 白 溶 液， 浓度已测为 ８ ． １ ５ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ ） ， 用０ ． ０ ３ｍ ｏ ｌ ／ Ｌｐ Ｈ８ ． ０Ｔ ｒ ｉ ｓ Ｈ Ｃ ｌ 缓 ０ ０ 、 ５ ０ 、 １ ０ 、 ５ 、 １μ ｇ ／ ｍ Ｌ 冲液将蛋白质分别稀释至 １ 和５ ０ ０ｎ ｇ ／ ｍ Ｌ标准浓度， 每个浓度做 ３次重复， 每 孔加入抗原液 １ ０ ０μ Ｌ 。随后向每个孔中继续加入 １ ０ ０μ Ｌ的 一 抗 （ 大豆球蛋白的兔抗体用 ０ ． ０ １ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 的Ｐ Ｂ Ｓ做 １ ０倍稀释） ， 在３ ７℃ 下孵育 ２ｈ 。取出后洗板 ３次， 甩干， 每孔加入 １ ０ ０μ Ｌ过 氧化物 酶 标 记 的 羊 抗 兔 二 抗 （ 用Ｐ Ｂ Ｓ稀 释 ３０ ０ ０ 倍） ， 再３ ７℃ 下继续孵育 ２ｈ 。取出 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 板， 再 次清洗 ３次 后 甩 干， 每孔加入 １ ０ ０μ Ｌ的 底 物 液 ［ 四甲基联苯胺（ Ｔ ＭＢ ） ］ 后立即放入 ３ ７℃ 黑暗处 反应 １ ０ｍ ｉ ｎ ， 再向每孔加入 ５ ０μ Ｌ的 终 止 液 终 止 反应， 最后用酶标仪测定 ４ ９ ０ｎ ｍ 波长条件下的吸 光度。基于检测光密度值（ Ｏ Ｄ 值） 的结果绘制标 准浓度蛋白质的曲线（ 以蛋 白 质 浓 度 的 对 数 为 横 坐标， ０为 １μ ｇ ／ ｍ Ｌ ， 以Ｏ Ｄ 值为纵坐标） ， 并确立 标准曲线 的 函 数 关 系 式。这 样， 在同等条件下检 测待检抗原的 Ｏ Ｄ值， 只要数值在标准曲线的函数 区间内， 就可求得待检抗原的浓度。
４期
谭 振等： 糖基化去除大豆球蛋白免疫原性方法的优化
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１ ． １ ． ２ 大豆球蛋白糖基化样品的制备 准 确 称 取 ４份 大 豆 球 蛋 白 样 品， 每份 ２ ０ｇ 。 分别以摩尔比 １ ∶ ４ 、 １ ∶ １ ４ 、 １ ∶ ３ ０和 １ ∶ ５ ２的比例与果 寡糖（ 相对分子质量为 ７ ４ １ ． ９ ） 混合（ 表１ ） ， 分别溶
４ ］ 为０ ． ８ ％） 很少的聚合蛋白质 ［ 。随着科学研究的 ［ ３ ］
１ 材料与方法
１ ． １ 试验材料 １ ． １ ． １ 大豆球蛋白的分离和粗提
１ １ ］ 参照 Ｓ ｅ ｔ ｓ ｕ ｋ ｏ等 ［ 的免疫法， 并做部分修改，
不断深入， 热 处 理、 发 酵、 酶 法 水 解、 基 因 改 造、 农 艺营养、 浸提 和 糖 结 合 等 方 法 已 被 用 来 去 除 大 豆 的致敏性
ａ Ｈ Ｃ Ｏ 凝胶 层 析 方 法 纯 化） ，用 Ｎ ３ 缓 冲 液 （ ５ ０ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ９ ． ５ ）稀 释 至 １ μ ｇ ／ ｍ Ｌ ， 每孔 ３ ０ ０μ Ｌ 大豆球蛋白抗原稀释液包被到 ９ ６孔板中， 在 ４℃ 下孵 育 过 夜 后 将 大 豆 球 蛋 白 包 被 液 甩 出， ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ） 缓冲液（ ０ ． ０ １ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的 用磷酸盐 －吐 温 （ Ｐ Ｂ Ｓ ， ｐ Ｈ７ ． ２ ， 含有体积分数为 ０ ． ０ ５ ％的 ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ２ ０ ） 将微孔板每 ３ｍ ｉ ｎ清洗 １次， 清洗 ３次（ 每孔加入 ３ ０ ０μ Ｌ ） ， 甩干， 每孔加入 １ ０ ０μ Ｌ的 １ ％ 牛血清白 蛋白（ 用浓度为 ０ ． ０ １ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 、 ｐ Ｈ７ ． ２的 Ｐ Ｂ Ｓ缓冲
［ ５ ］
。这些方法中以美拉德反应遮掩致敏
性为基础的还原糖结合蛋白质形式以其前景广阔 和安全性高的特点逐渐进入人们的视线。以往关 于美拉德反应对贝类过敏原 桃过敏原
［ ８ ］ ［ ６ ］
对大豆球蛋白进行分离。取 １ ０ ０ｇ脱脂大豆粉溶 于０ ． ０ ３ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 、 ｐ Ｈ８ ． ０的 ２ＬＴ ｒ ｉ ｓ Ｈ Ｃ ｌ 缓冲液中， 搅拌 １ｈ 后于 ４℃ 、 １ ００ ０ ０ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离心 ２ ０ｍ ｉ ｎ 。弃 去沉淀后 所 得 上 清 液 用 ２ｍ ｏ ｌ ／ ＬＨ Ｃ ｌ 调节 ｐ Ｈ至 ６ ． ４ ， ４℃ 、 １ ００ ０ ０ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离 心 ２ ０ｍ ｉ ｎ ， 所得沉淀即 为粗 １ １ Ｓ 部 分。 将 沉 淀 置 于 低 温 通 风 干 燥， － ２ ０℃ 条件下保存备用。
糖基化去除大豆球蛋白免疫原性方法的优化
谭 振 孙泽威
（ 吉林农业大学动物科学技术学院， 长春 １ ３ ０ １ １ ８ ）
摘 要： 为了优化糖基化去除大豆球蛋白免疫原性的方法， 本试验采用果寡糖与粗提大豆球蛋 白进行干热法糖基化反应， 选择不同的温湿度反应条件组合， 测定各个反应条件下 ０～ １ ２ ０ｈ产 物的蛋白质溶解状况及免疫原性去除效果。结果表明随着时间的推移， 各组产物的蛋白质溶解 均有下降， 而免疫原性去除效果增强， 其中在 ６ ５℃ 、 ７ ５ ％ 相对湿度、 蛋白质与糖摩尔比 １ ∶ １ ４时反 应６ ０ｈ 条件下蛋白质溶解及免疫原性去除效果最为理想。该条件可以作为干热法糖基化反应 去除大豆球蛋白免疫原性的优化方法。 关键词： 大豆球蛋白； 糖基化； 免疫原性； 果寡糖 中图分类号： Ｓ ８ １ ６ ． ９ 文献标识码： Ａ 文章编号： １ ０ ０ ６ ２ ６ ７ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ ０ ８ ８ ４ ０ ７ 大豆以 其 优 质 的 营 养 和 功 能 特 性， 广泛地应 用于食品与饲料行业。但是大豆中的抗原蛋白可
、 花生过敏原
［ ７ ］
、 樱
、 β－乳球蛋白
［ ９ ］
、 大豆蛋白
［ ５－ １ ０ ］
等过
敏原致敏性影响的研究， 得到的结果是有争议的， 所以至今美拉德反应产物对于过敏反应的作用仍 不完全清 楚。但 是， 以糖结合蛋白质的形式作为
收稿日期： ２ ０ １ ２－ １ ０－ ２ ６ 基金项目： 国家自然科学基金项目（ ３ １ ０ ７ ２ ０ ３ ７ ）
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动 物 营 养 学 报
２ ５卷
物蛋白质浓度情况。如图 ２和图 ３所示， 随着反应 时间的推移， 产物中蛋白质的浓度逐渐下降， 在反 应后 半 段 下 降 趋 势 相 对 于 反 应 起 始 阶 段 趋 于 平缓。
时各时间 点 之 间 均 差 异 显 著 （ Ｐ＜０ ． ０ ５ ） ， ６ ０ ３ ６ｈ 和７ ２ｈ之 间、 ９ ６和 １ ２ ０ｈ之 间 均 差 异 显 著 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） 。 在 ６ ５℃ 、 ６ ５ ％Ｒ Ｈ与 ６ ５℃ 、 ７ ５ ％Ｒ Ｈ２组间同 一反应时间的蛋白质浓度差异显著（ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 但 是６ ５℃ 、 ６ ５ ％Ｒ Ｈ与 ６ ５℃ 、 ５ ％Ｒ Ｈ２组间相差１ ２ｈ 时， ２组 数 据 会 趋 于 不 显 著。 ６ ５℃ 、 ７ ５ ％Ｒ Ｈ与 ７ ５℃ 、 ７ ５ ％Ｒ Ｈ２组间同一反应时间蛋白质浓度差 Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） ， ７ ５℃ 、 ７ ５ ％Ｒ Ｈ条件下， 产物蛋 异显著（ 白质浓度显著偏低。 通过同一条件下蛋白质 溶 解 状 况 的 比 较 （ 图 ２ 、 图３ ） ， 可知随着反应时间的推移， 各组反应产物 蛋白质的溶 解 水 平 均 有 下 降， 反应开始阶段下降 ６ｈ 之后整体上 明显， 之后下降趋势趋于平缓， 在３ 下降 趋 于 平 缓， 而 在 同 一 时 间 段 进 行 比 较 时， ７ ５℃ 、 ７ ５ ％Ｒ Ｈ条 件 组 合 的 产 物 蛋 白 质 浓 度 都 明 显偏低 于 其 他 ２组。 这 样 可 以 初 步 确 定 反 应 条 件， 温度在 ６ ５℃ 、 Ｒ Ｈ为 ６ ５ ％ 或者 ７ ５ ％。
作者简介： 谭 振（ １ ９ ８ ５ —） ， 男， 黑龙江佳木斯人， 硕士研究生， 研究方向为大豆抗营养因子。 Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ：３ ７ ８ ８ １ ５ ５ ２ ６ ＠ｑ ｑ ． ｃ ｏ ｍ 孙泽威， 副教授， 硕士生导师， Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ：ｓ ｕ ｎ ｚ ｅ ｗ ｅ ｉ ＠ｊ ｌ ａ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ 通讯作者：
为是主要的 食 物 过 敏 原， 这在工业发达国家更加 突出。近年 来， 世界上普遍认为大豆已经成为了 “ 健康杀 手” 。大 豆 球 蛋 白 （ ｇ ｌ ｙ ｃ ｉ ｎ ｉ ｎ ） 和 β－伴 大豆球蛋白（ ｃ ｏ ｎ ｇ ｌ ｙ ｃ ｉ ｎ ｉ ｎ ） 是致敏性最强的大豆 β 抗原蛋白， 占大豆籽实总蛋白质的 ６ ５ ％～ ８ ０ ％， 因 此也是大豆中主要的抗原蛋白。其中大豆球蛋白 大约占大豆中总蛋白质的 ４ ０ ％， 是一种含糖量（ 约
２ 结果与分析
２ ． １ 糖基 化 大 豆 球 蛋 白 产 物 蛋 白 质 浓 度 的 比 较 结果 采用 Ｂ Ｉ Ｐ Ｅ ＣＢ Ｉ Ｏ Ｒ Ｅ Ａ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ公司提供的 Ｂ Ｃ Ａ 蛋白质浓度测定试剂盒， 进行蛋白质浓度的测定。 首先绘制 出 蛋 白 质 标 准 曲 线 （ 图１ ） ， 之后进行糖 基化产物检测。 测定不同温湿度条件下不同摩尔比的各组产
动物营养学报 ２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ４ ） ： ８ ８ ４ ８ ９ ０ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅＪ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ａ ｎ ｉ ｍ ａ ｌ Ｎ ｕ ｔ ｒ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ６ ２ ６ ７ ｘ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ４ ． ０ ２ ９
１－ ２ ］ 引起婴儿、 仔 猪、 犊 牛 等 幼 龄 动 Hale Waihona Puke Baidu 过 敏［ ， 被认
改变大豆致 敏 结 构、 掩饰抗原致敏性并增强其功
１ ０ ］ ｓ ｕ ｉ 等［ 发现采用半 能特性的方法已经被认可。 Ｕ
乳糖和壳聚 糖 结 合 大 豆 蛋 白， 可降低大豆蛋白产 生的过敏 反 应。为 此， 本研究旨在以果寡糖和大 豆球蛋白为原料， 利用干粉糖基化方法， 使抗原蛋 白与果寡糖 发 生 有 效 的 糖 基 化 改 性， 通过观测糖 基化前后对抗原蛋白的免疫原性变化和蛋白质溶 解状况， 建立 果 寡 糖 与 大 豆 抗 原 蛋 白 体 外 糖 基 化 工艺， 优化糖基化反应条件。
１ ． ２ 试验方法 １ ． ２ ． １ 糖基化大豆球蛋白反应 将不同比例的大豆球蛋白 －糖混合物置于底 部含有饱和 碘 化 钾 水 溶 液 的 干 燥 器 中， 在特定的 温度 与 相 对 湿 度 （ Ｒ Ｈ）组 合 （ ６ ５ ℃、 ６ ５ ％Ｒ Ｈ ； ６ ５℃ 、 ７ ５ ％Ｒ Ｈ ； ７ ５℃ 、 ７ ５ ％Ｒ Ｈ） 条件下分别进行 孵育。孵育的样品分别在 ０ 、 １ ２ 、 ２ ４ 、 ３ ６ 、 ４ ８ 、 ６ ０ 、 ７ ２ 、 ８ ４ 、 ９ ６ 、 １ ０ ８和 １ ２ ０ｈ 时间点取样， 然后在 － ２ ０℃ 保 存待 测 （ 方法参照 Ｊ ü ｒ ｇ ｅ ｎ等 体系） 。 １ ． ２ ． ２ 糖基化大豆球蛋白产物的溶解 取 ０ ． ５ｇ 反应产物溶于 ５ｍ Ｌ０ ． １ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的磷 酸盐缓冲液（ Ｐ Ｂ Ｓ ） 中， 用测力搅拌器搅拌均匀， 提 取 １ｈ后， 离心（ ４℃ 、 １ ００ ０ ０ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ， ２ ０ｍ ｉ ｎ ） 取上 清液。采用二喹啉甲酸（ Ｂ Ｃ Ａ ） 蛋白质浓度测定试 剂盒进行蛋 白 质 浓 度 测 定， 比较相同溶液下各组 反应产物的溶解状况。 １ ． ２ ． ３ 糖基化大豆球蛋白产物免疫活性测定 参考 Ｚ ｈ ａ ｏ 等
于蒸馏水中， 形成质量体积比为 １ ０ ％ 的蛋白质溶 液。用稀 Ｈ Ｃ ｌ 或稀 Ｎ ａ Ｏ Ｈ调节溶液 ｐ Ｈ到 ７ ， 然后 搅拌 １ ０ｍ ｉ ｎ ， 冷冻干燥制得不同比例的大豆球蛋 白－ 糖混合物， － ２ ０℃ 保存备用。
表１ 大豆球蛋白与果寡糖的混合比例 Ｔ ａ ｂ ｌ ｅ １ Ｒ ａ ｔ ｉ ｏｏ ｆ ｇ ｌ ｙ ｃ ｉ ｎ ｉ ｎｔ ｏｆ ｒ ｕ ｃ ｔ ｏ ｏ ｌ ｉ ｇ ｏ ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｉ ｄ ｅ 摩尔比 Ｍｏ ｌ ａ ｒ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ 大豆球蛋白 Ｇ ｌ ｙ ｃ ｉ ｎ ｉ ｎ ／ ｇ 果寡糖 Ｆ ｒ ｕ ｃ ｔ ｏ ｏ ｌ ｉ ｇ ｏ ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｉ ｄ ｅ ／ ｇ １ ∶ ４ ２ ０ ０ ． １ ６ ９６ １ ∶ １ ４ ２ ０ ０ ． ５ ９ ３６ １ ∶ ３ ０ ２ ０ １ ． ２ ７ ２０ １ ∶ ５ ２ ２ ０ ２ ． ２ ０ ４６