细胞培养实验课程SOP
细胞生物操作规程(3篇)
第1篇一、引言细胞生物学实验是现代生物学研究的重要手段之一。
为了确保实验结果的准确性和可靠性，特制定本操作规程。
本规程适用于所有进行细胞生物学实验的人员。
二、实验前准备1. 实验室环境：实验室应保持整洁、安静、通风良好，实验台面清洁，无菌操作区域明确。
2. 实验材料：根据实验需求准备相应的细胞、试剂、仪器等，确保材料质量合格。
3. 实验设备：检查实验设备是否正常，如显微镜、离心机、培养箱、净化工作台等。
4. 实验操作人员：实验操作人员应具备一定的细胞生物学实验技能，熟悉实验操作规程。
三、细胞培养1. 细胞复苏：将冻存的细胞按照细胞冻存和复苏标准操作规程进行复苏。
2. 细胞传代：根据细胞生长状态，定期进行细胞传代。
传代过程中，注意无菌操作，避免污染。
3. 细胞培养条件：保持细胞培养箱温度、湿度、CO2浓度等参数稳定，确保细胞生长良好。
4. 细胞观察：定期观察细胞生长状态，如细胞形态、密度等，必要时进行拍照记录。
四、细胞染色与观察1. 细胞染色：根据实验需求，选择合适的染色方法对细胞进行染色。
2. 显微镜观察：使用显微镜观察染色后的细胞，注意调整光圈、焦距等参数，确保观察效果。
3. 图像采集：使用图像采集系统对细胞进行拍照，记录实验结果。
五、细胞分离与纯化1. 细胞分离：根据实验需求，采用酶消化、离心等方法分离细胞。
2. 细胞纯化：通过流式细胞术、磁珠分离等方法对分离的细胞进行纯化。
六、细胞转染与表达1. 细胞转染：根据实验需求，选择合适的转染方法对细胞进行转染。
2. 转染效率检测：通过荧光素酶报告基因、荧光显微镜等方法检测转染效率。
3. 基因表达分析：通过RT-qPCR、Western blot等方法检测转染细胞的基因表达水平。
七、实验记录与报告1. 实验记录：详细记录实验过程、操作步骤、结果等，确保实验数据的真实性。
2. 实验报告：整理实验结果，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、讨论等。
八、实验安全与环保1. 生物安全：严格遵守生物安全操作规程，避免生物危害。
SOP-细胞常规维持培养
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)GII式显带法 (21)N式显带法 (21)R(反式)显带法 (23)姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)荧光原位杂交操作程序 (25)附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)天平称量操作规程 (27)药匙处理操作规程 (27)PBS配制规程 (28)胰酶配制规程 (28)培养基配制规程 (29)1N HCL配制规程 (29)1N N A OH配制规程 (29)外周⾎培养及染⾊体的识别1. 原理：外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G0期或G1期，⼀般情况下是不分裂的。
当在培养基中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。
经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。
2. 外周⾎培养与收获操作步骤：2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。
2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。
2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。
2.4. 制⽚过程：2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。
DC细胞、CIK细胞SOP
DC-CIK培养操作流程1.单采获取血液50ml分别置于2支50ml离心管中，2500r/min离心5min后，把黄色上清液倒入新的50ml离心管中离心灭活备用（注意不要倒掉白膜层），剩下的合并到一支离心管中并加入生理盐水至25ml混匀。
2.另取一支50ml离心管，加入25ml淋巴细胞分离液，用无菌吸管小心的将上述血细胞悬液沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液的表面，使两者之间形成清晰的界面。
3.2000r/min，离心20min后，用滴管轻轻插到白膜层，吸出该层细胞（注意观察淋巴细胞分离液层的红细胞，尽量不要吸到红细胞）。
移入另外的离心管里，加生理盐水至50ml，混匀，1500r/min，离心5min，弃上清，将底部细胞混匀，再加入生理盐水，，按照1500r/min，离心5min离心洗涤两次。
4.最后一次离心结束后，弃上清，用手轻柔的晃动离心管，把细胞晃匀，用培养液将沉淀细胞重悬，根据回输安排把所有细胞平均分配到规定数量的225ml培养瓶中，每瓶中培养液的量为20--30ml，放入培养箱中进行培养。
5. 2-12h后，取出培养瓶，将6瓶内悬浮细胞液收集到离心管，平均的分置在2个182CM 培养瓶中，再向6瓶DC培养瓶内加入30ml CIK细胞培养液，和H1因子。
置于培养箱中以DC(贴壁)细胞培养。
当天记为第0天。
6. 3个182CM²培养瓶中，分别补培养液至100ml，并分别加入γ因子，自体血清，置于培养箱中以CIK（悬浮）细胞培养。
当天记为第0天。
7. 24小时后向CIK细胞液中加入CI因子。
继续培养。
8.应定期观察细胞生长状态，当培养液变黄时，需要补液（每两至三天补液一次，偶尔也有一天换液的情况）。
CIK细胞补液后，按培养基全部液体体积，按终浓度为2ul/ml的比例加入白介素-2因子。
当补液后培养液体积超过200ml时，把全部两瓶CIK细胞连同培养液转移至培养袋中。
9.培养第6天，向所有DC细胞培养瓶中加入特异的细胞靶向激活液。
细胞培养技术操作规范
细胞培养技术操作规范细胞培养是一项重要的实验技术，用于研究细胞的生物学特性及其在疾病治疗和药物开发中的应用。
为了确保实验结果的准确性和可重复性，需要遵循一系列的操作规范。
本文档旨在提供细胞培养技术的操作规范，以帮助研究人员顺利进行实验。
实验室准备- 实验室应保持干净整洁，设施设备应处于正常运行状态。
- 所有使用的试剂和培养物应检查保质期，并妥善存放在适当的温度下。
- 工作平台及工作台面应进行消毒处理，以防止细菌和真菌的污染。
- 所有使用的器械和培养罐应在使用前进行高压蒸汽灭菌。
细胞培养操作细胞培养器具的准备- 使用无菌操作进行所有操作，包括试剂和培养基的添加、培养器具的取用等。
- 使用带无菌手套的清洁无菌工作台进行操作。
- 细胞培养器具（如培养瓶、孔板等）在使用前应进行高压蒸汽灭菌处理，确保无菌状态。
培养基的准备- 准备培养基前应检查其成分和配比是否正确，确保培养基的质量。
- 使用无菌操作取出所需量的培养基，并避免直接接触细胞培养器具。
- 遵循培养基的配制方法和步骤，确保其与细胞的适应性。
细胞的分离与传代- 分离细胞时，使用胰酶等消化酶进行细胞的释放，并遵循操作步骤和浓度要求。
- 记录分离细胞的季度数，避免过度传代，以保持细胞的稳定性和特性。
- 合理设置细胞传代次数和细胞数量，避免细胞过早进入衰老状态。
培养条件和操作- 确保培养器具与细胞接触的表面无菌、干净，避免细胞污染或黏附的问题。
- 控制培养环境的温度、湿度和二氧化碳浓度，以满足不同类型细胞的生长要求。
- 定期更换培养基，确保细胞得到足够的营养物质和生长条件。
- 注意培养器具和试剂的使用方法和操作顺序，避免对细胞生长和健康产生负面影响。
细胞培养操作的记录与管理- 记录每次细胞培养的详细信息，包括培养时间、细胞密度、培养基配制方法等，以便于实验结果的追溯和分析。
- 管理细胞的库存，包括标识、记录和储存，以确保细胞的可追溯性和可重复性。
- 定期检查细胞的污染和变异情况，及时采取必要的措施防止实验结果的偏差。
细胞培养常规操作流程
细胞培养常规操作流程英文回答：Cell culture is a fundamental technique in biological research, allowing scientists to study and manipulate cells in a controlled environment. The standard procedure forcell culture involves several key steps.First, I need to prepare the culture medium. This is the nutrient-rich solution that provides cells with the necessary nutrients and growth factors to survive and multiply. The medium is usually composed of a basal medium, such as DMEM or RPMI, supplemented with fetal bovine serum, antibiotics, and other additives. I carefully measure and mix the components to ensure a proper balance of nutrients.Next, I sterilize all the equipment and materials that will come into contact with the cells. This includes the culture dishes, pipettes, and media bottles. Sterilization can be achieved by autoclaving, which uses high-pressuresteam to kill any microorganisms present. Alternatively, I can use a filter to remove bacteria and fungi from the media.Once everything is sterilized, I can start the cell culture process. I thaw frozen cells or obtain fresh cells from a tissue sample. I then count the cells using a hemocytometer or an automated cell counter. This step is important to determine the cell density and ensure that I seed the appropriate number of cells for the experiment.After counting the cells, I seed them into the culture dishes or flasks. The dishes are usually coated with a substance that promotes cell attachment, such as collagen or gelatin. I carefully distribute the cells evenly across the surface and place the dishes in an incubator set at the appropriate temperature and CO2 concentration. The incubator provides a controlled environment that mimics the conditions inside the body.Over the next few days, I regularly check the cells under a microscope to monitor their growth and health. Ialso change the culture medium every 2-3 days to provide fresh nutrients and remove waste products. This process is known as feeding the cells.Sometimes, I need to subculture the cells to maintain their health and prevent overcrowding. This involves detaching the cells from the culture dish using an enzyme called trypsin, and then transferring them to a new dish with fresh medium. Subculturing allows the cells to continue growing and dividing without becoming too dense.Throughout the cell culture process, I need to maintain aseptic technique to prevent contamination. This means working in a clean and sterile environment, wearing gloves, and using sterile tools. Contamination can lead to the growth of unwanted microorganisms and compromise the experiment.In conclusion, cell culture is a meticulous processthat involves preparing the culture medium, sterilizing equipment, seeding the cells, maintaining them in the incubator, and regularly feeding and monitoring theirgrowth. It requires attention to detail, patience, and aseptic technique to ensure successful cell culture experiments.中文回答：细胞培养是生物研究中的一项基本技术，允许科学家在受控环境中研究和操作细胞。
NK细胞培养SOP
NK 细胞培养sop日程：第0天：NK激活剂的处理，分血第2天：补液20ml第4天：补液第7天：装袋第9天：补液第11 天：分袋第13 天：检菌第14、15 天：收获1. 研究背景与目的采用从病人自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使其扩增活化，再静脉回输，将其输回病人体内，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。
2. 定义和缩写2.1. NK 自然杀伤细胞2.2. rhIL-15 人源重组白细胞介素152.3. IL-2 白细胞介素3. 主要仪器、耗材3.1. 仪器3.1.1 生物安全柜3.1.2 流式细胞仪3.1.3 水平低速离心机3.1.4 灭菌锅3.1.5 CO 2 孵箱3.1.6 倒置显微镜3.1.7 血细胞记数器3.1.8 血细胞计数板3.1.9 移液器3.1.10 -20℃-4℃冰箱3.2. 耗材3.2.1 75cm2培养瓶3.2.2 225 cm2培养瓶3.2.3 移液管3.2.4 15ml、50ml离心管、250ml离心管3.2.5 医用塑胶手套3.2.6 一次性帽子、手套3.3. 试剂3.3.1 无血清培养液3.3.2 IL-2 (100万IU/瓶)3.3.3 IL-153.3.4 0.4%苔盼蓝溶液3.3.5 生理盐水3.3.6 人淋巴细胞分离液3.4 原材料3.4.1 外周血，脐血，骨髓等4 操作步骤分血：4.1 培养瓶的处理：吸取NK细胞激活剂500ul，用生理盐水稀释至6ml，加到75cm 2 的培养瓶中混匀后，放置于37°C。
1h后取出备用。
4.2 将不同来源的血样，用生理盐水稀释一倍；4.3 Ficoll密度梯度离心，2000rpm，25分钟；4.4 吸取血浆，置56°C，灭活20min；灭活血浆，3000rpm，15min；4.5 白膜层用移液管吸入到新的50ml离心管中，用生理盐水洗涤细胞两次，第一次为2100rpm，6min；第二次为1500rpm，6min；4.6 从培养箱中取出处理的培养瓶，吸除激活剂，加入生理盐水10ml，轻轻晃动培养瓶，吸除生理盐水；4.7 用10-15mlNK培养液重悬细胞悬液，同时补加10%血浆，1000U/ml的IL-2,50ng/ml IL-15；将细胞置于CO2培养箱中培养。
细胞培养标准操作规程
细胞培养标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事细胞培养的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
1、所需试剂细胞培养液、血清、胰酶、PBS或Hank`s液
2、规程：
2.1 细胞株的培养
2.1.1 获取所需细胞株（一般细胞株的运送是把细胞放在培养瓶中，干冰保存运输的）
2.1.2 得到所需细胞株后弃掉多余的培养液，放到5%的CO2培养箱中培养
2.1.3 每天至少观察一次，待细胞长满整个培养瓶的80%时传代
2.1.4 倒掉培养液，用1mlPBS 漂洗细胞一次，加入500ul胰酶消化，消化时间视细胞种类、胰酶浓度和消化温度而定，一般3-5min
2.1.5 终止消化，向上一步消化液中加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.1.6 吹打，用吸管轻轻吹打至细胞全部脱落，注意尽量减少气泡产生
2.1.7 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.1.8 将细胞接种到另外的培养瓶中
2.1.9 换液，根据细胞生长情况，间隔一定时间半量换液。
2.2 原代细胞培养
2.2.1 原代细胞的获取无菌条件下取动物组织剪碎
2.2.2 向剪碎的动物组织加入适宜浓度的胰酶，消化，时间因细胞种类和胰酶浓度而定
2.2.3 终止消化，向上一步消化叶重加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.2.4 吹打将终止消化后的组织转入一培养皿中，加入一定量的培养液轻轻吹打数次，静置5-10分钟
2.2.5 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.2.6 将细胞接种到培养瓶或培养板中，放入5%的CO2培养箱中培养。
细胞培养操作指南
细胞培养操作指南1.实验室准备：在开始细胞培养之前，准备好所有所需的实验室设备和试剂：培养皿、细胞培养基、胎牛血清、无菌移液器、无菌离心管、显微镜等。
2.个人准备：进入实验室前，务必穿戴好个人防护装备，包括实验室服、手套和口罩。
确保双手清洁，并使用含酒精的消毒液消毒工作台。
3.细胞培养基准备：根据实验需求，配制适当的细胞培养基。
将细胞培养基加热至37摄氏度，使其变得温暖。
4.细胞扩增与传代：a.从冷冻保存的细胞存储管中取出细胞，并将其转移到一只预先加热的离心管中。
b.离心管轻轻离心，使细胞沉淀在管底。
c.弃去上清液，加入预先加热的新鲜培养基，轻轻悬浮细胞沉淀。
d.将细胞悬液转移到一个新的培养皿中，确保细胞均匀分布。
e.将培养皿放入恒温培养箱，并根据细胞类型和实验要求设置合适的温度和湿度。
f.观察细胞生长情况，并根据需要传代细胞。
传代细胞时，将细胞悬液转移到新的培养皿中，注意细胞定植的密度不要太高。
5.细胞分裂与凝聚度检测：使用显微镜观察细胞培养的生长情况，检查细胞的形态和凝聚度。
正常细胞应该呈现光滑、扁平、并且凝聚在一起的形态。
6.细胞的移植和收获：当细胞生长到适当的数量时，可以进行细胞的移植或收获。
使用无菌移液器将细胞转移至其他试管或培养皿中，确保操作环境和使用器皿都是无菌的。
7.细胞冻存：根据实验的需要，将细胞制备成冻存物。
将细胞悬液转移到冻存保存培养基中，并加入适量的冷冻保护剂（如DMSO），在-80摄氏度的冰箱中快速冷冻。
8.废弃物处置：在培养过程中产生的废弃物（例如培养皿、试管等），必须按照实验室的规定进行处理。
通常情况下，将废弃物放入带有生物危险标识的废物箱中。
9.清洗和消毒：在培养工作完成后，清洗并消毒实验室工作台和使用的器皿。
使用含酒精的消毒液对工作台表面进行擦拭，并将使用过的器皿彻底清洗，并经过高温高压灭菌。
10.实验记录：进行细胞培养时，要详细记录每个操作步骤，包括使用的细胞类型、培养方法、检测结果等。
细胞培养常规操作流程
细胞培养常规操作流程英文回答：Cell culture is a fundamental technique used in biological research and biotechnology. It involves the growth and maintenance of cells in a controlled environment, providing a platform for studying cellular behavior, drug discovery, and tissue engineering. Here, I will outline the general workflow of cell culture operations.1. Cell Line Selection:The first step in cell culture is to select an appropriate cell line for the study. This can vary depending on the research objectives. For example, if I am interested in studying cancer cells, I might choose a well-established cancer cell line like HeLa cells.2. Preparation of Culture Medium:Next, I prepare the culture medium, which provides the necessary nutrients and growth factors for the cells. The medium composition can vary depending on the cell type. For example, I might use DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) supplemented with fetal bovine serum, antibiotics, andother additives.3. Sterilization and Aseptic Technique:To maintain a sterile environment, I sterilize all the equipment and materials that will come into contact withthe cells. This includes the culture dishes, pipettes, and media bottles. I also follow aseptic techniques, such as working in a laminar flow hood and wearing gloves, to minimize the risk of contamination.4. Cell Seeding and Passage:Once the cells are ready, I seed them onto a culture dish or flask. The seeding density can vary depending onthe cell type and experimental requirements. After acertain period of growth, the cells reach confluence andneed to be passaged. This involves detaching the cells from the culture vessel, usually using trypsin, and transferring them to a new dish or flask.5. Monitoring and Maintenance:During the cell culture process, I regularly monitor the cells for their growth and overall health. This includes checking for signs of contamination, such as bacterial or fungal growth. I also maintain the cells by regularly changing the culture medium, adjusting the pH level, and providing fresh nutrients.6. Experimental Manipulations:Once the cells have reached the desired confluence and are in a healthy state, I can perform various experimental manipulations. This can include treatments with different drugs or chemicals, genetic modifications, or exposure to specific environmental conditions.7. Cell Harvesting:At the end of the experiment or when I need to collect the cells for downstream analysis, I harvest them. This involves detaching the cells from the culture dish or flask and collecting them in a centrifuge tube. The harvested cells can then be used for further analysis, such as protein or RNA extraction.中文回答：细胞培养是生物研究和生物技术中的一项基本技术。
胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP
胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP一、样本接收1.正常足月顺产男婴，与产妇及其家属签署知情同意书后，在产房无菌条件下获取胎盘，放至无菌袋中，4℃运输至细胞中心。
2.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。
3.查看客户信息是否与交接表一致。
4.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。
二、胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种1.准备耗材试剂：15cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、封口膜、100目滤网过筛、灭菌手术刀、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、DPBS、双抗、75%酒精（已过滤）、Ⅰ型胶原酶。
2.仪器设备准备及预热：生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机、电动移液器、倒置相差显微镜、摇床（37℃150r/min）。
3.将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。
4.将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，实验中所需要的相关试剂及耗材等喷酒精擦拭放入生物安全柜中。
5.取无菌托盘，加入含1%青链霉素的DPBS，将胎盘组织放入其中，并取适量样本保存液留样送检支原体。
并洗涤组织两三次，洗去表面的血污，直至清洗的液体无血色。
6.清洗结束后，将胎盘放入无菌托盘中，然后使用无菌剪刀分离胎盘底部靠近母体一侧的蜕膜组织，再将蜕膜组织剪碎至1-3mm3的微小组织块，加DPBS定容离心，500g 5min。
7.离心结束后，去上清。
按照蜕膜组织与消化液体积比为2:5的比例加入消化酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化至少一个小时，再按消化酶与0.05%的胰酶体积比为1:1的比例加入0.05%的胰酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化15min。
8.用无血清干细胞培养基终止消化，吹打悬液20-30次，打散组织，混匀细胞，将消化的组织液通过100um细胞筛网过滤出组织和胎盘蜕膜间充质干细胞两部分，组织留在滤网上，下层则是细胞悬液，加DPBS定容混匀离心。
NK细胞培养SOP
NK细胞制备与培养标准操作流程1 目的与范围：1.1 目的：规范NK细胞培养操作流程，保证NK细胞产品制备的稳定性、均一性。
1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员对NK细胞培养的全过程。
2 文件：2.1 NK细胞制备与培养标准操作流程3 记录：3.1 NK细胞制备与培养记录表、操作1间清场记录表4 试剂、耗材与仪器设备：4.1 试剂：75%酒精、D-PBS缓冲液或生理盐水、淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、自体血清、A/B/C/D/E因子、IL-2。
4.2 耗材：T175培养瓶、1.5L培养袋、15ml离心管、50ml离心管、50ml一次性注射器、5ml一次性注射器、1ml一次性注射器、10ml移液管、1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、巴斯德滴管、0.2ml Ep管、0.22um一次性过滤器。
4.3 仪器设备：超净工作台、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱、水浴锅、电动移液枪、1ml手动移液枪、200ul手动移液枪、医用剪刀、医用止血钳、试管架、50ml注射器支架、托盘。
5 工作程序：5.1 实验前准备：5.1.1 洁净区需经紫外线照射，连续照射时间≥30min，实验室共作过程中风机始终保持开启运行状态。
5.1.2 超净工作台需经过开机紫外线照射，照射时间≥30min，开机风机运行≥10min。
开启超净工作台玻璃防护窗，待超净工作台内部气流稳定后才可使用。
5.1.3 将实验室所需的器械、耗材放于物料传递窗进行紫外线照射≥30min（器械与各规格的移液枪头必须经过高温高压灭菌锅消毒灭菌，且在合格期内），照射完毕后将器械包与所需耗材用75%酒精纱布擦拭外包装消毒后放入超净工作台内备用。
5.1.4 将淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、PBS缓冲液或生理盐水提前30min从4℃冰箱取出，用75%酒精纱布擦拭后放入超净工作台，恢复至室温备用。
5.1.5 A/B/C/D/E因子、IL-2在使用时提前10min从-20℃冰箱取出，即用即取，禁止在常温状态下长期放置。
标准操作规程(SOP)——细胞计数
一、目的细胞计数法是细胞学实验中进行细胞计数的基本方法，通过细胞计数，能够保证实验的准确性、稳定性和可重复性。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行细胞计数的操作。
三、定义细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。
一般利用计数板（红细胞计数板）进行。
即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。
不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。
四、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-2（二）材料1．生长成片的MDCK 细胞2．血细胞计数板3．1mL 、10mL 无菌移液管4．台盼蓝（0.4% PBS 溶液）建议：经常检查试剂使用的有效期（三）实验步骤1．消化细胞（方法见MDCK 细胞培养标准操作规程）。
2．用血细胞计数板来计算细胞悬液中的细胞数，需要充分分散细胞。
3．在18μL 台盼蓝（0.4% PBS 溶液）中加入2μL 细胞悬液，混匀，成10倍标准操作规程（SOP稀释。
死细胞被染成蓝色。
4．将以上细胞悬液加入到血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下计数。
5．计算计数室四个角上三线包围的正方形中的活细胞，压线的细胞计数遵循计数原则，数上不数下，数左不数右。
如果观察到成片或者成团的细胞，应重新悬浮细胞液，重新计数。
用以下公式计算每毫升悬液中活细胞的数量。
C=4个角正方形内的活细胞总数/4×104×10C：每毫升活细胞数；五、参考文件《流行性感冒诊断标准》。
细胞培养标准操作程序(SOP)
细胞培养标准操作程序（SOP）1．目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：3.1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。
注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)
一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。
由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM 是500ml。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
细胞培养标准操作程序(SOP).docx
细胞培养标准操作程序（SoP1.目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2 .适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3 •操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 100Oml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2〜3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCo3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml× 10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2〜3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌,按说明添加成分（如InVitrogen公司的RPMl-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g , InVitrogen公司的DMEM需加NaHCo3粉3.7g等），再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M （1mol∕L ）HCl调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2〜7.4生长，配制好后PH值会升高0.2〜0.3 ,故配时调PH至7.0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素80万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml ,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22Um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20 C保存备用。
注意：（1 ）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml× 10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
胚胎干细胞培养操作规程
胚胎干细胞培养操作规程胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有无限的增殖能力和多能性分化潜能，对于组织再生和疾病治疗具有重要的应用价值。
为了进行胚胎干细胞的培养和扩增，下面给出一份胚胎干细胞培养操作规程。
1. 实验前准备：a. 清洗培养器具：用无菌水洗净培养皿、玻璃器皿和刷子。
b. 预热培养液：根据实验需要预热胚胎干细胞培养基和所需的其他培养液，以确保适宜的温度。
2. 细胞除菌：a. 必要时，用无菌棉签将细胞悬液接种到新的培养皿中。
b. 将枪头含有70％乙醇的吸管对准培养皿，喷洒乙醇并晾干。
c. 将培养皿放置在超净工作台内，进行进一步的消毒和清洁操作。
3. 细胞接种：a. 取出细胞悬液，并与培养基按照比例混合。
b. 将胚胎干细胞悬液均匀地接种到预先涂覆有明胶或者植物凝胶的培养皿上。
c. 确保培养皿中的细胞接种均匀且不过于密集，以便细胞能够自由生长。
4. 细胞培养：a. 将被接种的培养皿置于培养箱中，在37℃和5% CO2的条件下培养。
b. 每天检查和观察细胞的状态和生长情况，观察细胞的形态和数量。
c. 根据需要，定期更换新鲜的培养基。
5. 细胞分离：a. 当细胞达到足够密度时，可使用胰蛋白酶等酶来进行细胞的分离。
b. 向培养皿中加入足够的酶液，并将其均匀地涂抹在细胞上。
c. 在温度适宜的条件下，观察细胞的分离情况，并在适当的时间停止酶的作用。
6. 细胞传代：a. 轻轻将细胞悬液转移到新的培养皿中，避免细胞团的形成。
b. 加入新的培养基，使细胞能够继续生长和分化。
c. 定期观察和记录细胞的生长情况，监测细胞的纯度和分化状态。
7. 储存和保存：a. 使用液氮分装装置将细胞悬液分装到液氮管中。
b. 储存液氮管在液氮罐中，确保细胞的存活和完整性。
c. 定期检查和更新细胞的库存记录，确保细胞的有效使用和管理。
通过以上的操作规程，可以进行有效的胚胎干细胞的培养和扩增工作，为进一步的研究和应用奠定基础。
NK细胞培养SOP
NK细胞制备与培养标准操作流程1 目的与范围：1.1 目的：规范NK细胞培养操作流程，保证NK细胞产品制备的稳定性、均一性。
1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员对NK细胞培养的全过程。
2 文件：2.1 NK细胞制备与培养标准操作流程3 记录：3.1 NK细胞制备与培养记录表、操作1间清场记录表4 试剂、耗材与仪器设备：4.1 试剂：75%酒精、D-PBS缓冲液或生理盐水、淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、自体血清、A/B/C/D/E因子、IL-2。
4.2 耗材：T175培养瓶、1.5L培养袋、15ml离心管、50ml离心管、50ml一次性注射器、5ml一次性注射器、1ml一次性注射器、10ml移液管、1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、巴斯德滴管、0.2ml Ep管、0.22um一次性过滤器。
4.3 仪器设备：超净工作台、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱、水浴锅、电动移液枪、1ml手动移液枪、200ul手动移液枪、医用剪刀、医用止血钳、试管架、50ml注射器支架、托盘。
5 工作程序：5.1 实验前准备：5.1.1 洁净区需经紫外线照射，连续照射时间≥30min，实验室共作过程中风机始终保持开启运行状态。
5.1.2 超净工作台需经过开机紫外线照射，照射时间≥30min，开机风机运行≥10min。
开启超净工作台玻璃防护窗，待超净工作台内部气流稳定后才可使用。
5.1.3 将实验室所需的器械、耗材放于物料传递窗进行紫外线照射≥30min（器械与各规格的移液枪头必须经过高温高压灭菌锅消毒灭菌，且在合格期内），照射完毕后将器械包与所需耗材用75%酒精纱布擦拭外包装消毒后放入超净工作台内备用。
5.1.4 将淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、PBS缓冲液或生理盐水提前30min从4℃冰箱取出，用75%酒精纱布擦拭后放入超净工作台，恢复至室温备用。
5.1.5 A/B/C/D/E因子、IL-2在使用时提前10min从-20℃冰箱取出，即用即取，禁止在常温状态下长期放置。
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实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞、PK-15：猪肾传代细胞、IBRS-2：猪肾传代细胞、Hela：人的子宫瘤细胞、Vero：非洲绿猴肾细胞、Marc-145：来源于Vero细胞、Sf9：昆虫细胞。
三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
七、传代细胞系培养1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
细胞培养步骤：①取长满单层的细胞一瓶，掉到培养液。
②加入2ml胰酶消化液，置于37℃培养几分钟（也可以轻轻吹打几下），直到细胞间出现空隙或细胞变圆后倒掉消化液。
（目的就是让细胞脱离贴壁状态，但不掉下来）③加入生长液，吹打几次，使细胞分散成单个细胞（两三个聚集一起这种程度就好），然后分装于3个小瓶中，在每个瓶中补充生长液至10ml。
注意：胰酶消化不能太长（此时细胞大量脱离，会造成细胞损失，后面加生长液吹打时也不容易分散成单个细胞，容易成块，培养后长得不光滑）细胞冻存冻存液：现在一般用二甲亚砜，也可以用甘油。
步骤：1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；4. 离心1000rpm，5min；5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml（不要加满，看冻存管的规格）7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞复苏目的：下一步实验需要或检测细胞冻存质量步骤：1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子（超净台操作），用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心，1000rpm，5min；4. 弃去上清液（为了去掉冻存液），加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数（一般情况可以不用计数，尽快培养），调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养步骤：①取长满单层的细胞，倒掉培养液（PEDV需要在①②步骤间架10ug/ml的胰酶，便于PEDV的体外生长）②加入适量病毒悬液③置温箱中感作（吸附）45min~1h。
（即给予病毒入侵细胞并增值自己的时间）④取出瓶子，倒掉培养液，补充维持液，置温箱中继续培养，直至80%细胞病变⑤收毒：将病变细胞至于-20℃冰箱中，冻存后取出自然解冻（冻融一般需要重复几次，以得到更多病毒液），解冻过程振荡几次，以使得细胞完全从瓶壁上脱落，然后将病毒液手机于盐水瓶或其他瓶中，低温贮藏备用。
（病毒入侵细胞过程：吸附~入侵~脱壳~病毒大分子合成~装配~成熟~释放）实验二、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）一、实验目的了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。
二、材料1、9-11日龄鸡胚（不宜过大，不然剪碎组织较为困难，杂细胞较多）2、照蛋灯与蛋座3、碘酊棉球与酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小镊子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、6、胰酶、生长液、维持液三、细胞培养的条件要求1）细胞密度原代细胞：4-6×105个/ml传代细胞：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃四、操作步骤1、取9-11日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM（含10%FBS）冲冼2次。
4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。
如此反复冲洗2-3遍。
6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。
9、细胞计数取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
五、结果的观察于培养后每天观察结果，至长层单层。
细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。
注意事项：①无菌，②组织块务必切成小块，③严格控制胰酶消化时间，④做好标注。
实习三鸡胚肾细胞（CEK）和鸡胚气管（CET）器官培养物的制备目的：1.掌握CEK和CET制备方法。
2.认识CEK的显微形态和CET纤毛摆动状态。
材料：19-21天龄戏鸡胚、0.25%胰酶、Hanks水解乳蛋白液（每100ml加小牛血清10ml和1ml庆大霉素，用于CEK培养；而用于CET的维持液无须加小牛血清）、平皿、塑料吸头，其余用品同实习三。
内容与方法：1.CED制备（1）用洒精棉擦拭、火焰灼烧剪刀、镊子，准备好平皿。
（2）用洒精棉消毒蛋壳，无菌操作打开蛋的气室，剪断颈椎胸段，将头颈放入平皿（留做CET），用镊子挟稳胸椎，沿胸椎两侧剪去翼，稍向外侧剪去腿，直至泄殖腔前剪去尾部，在此过程从上到下去除胸腹腔内脏及生殖器官。
（3）用镊子钝性分离并取下肾脏，剪碎，BSS洗2次，倒入三角瓶。
（4）加入0.25%胰酶10ml，于37℃水浴消化30分钟，迅速用BSS将组织块轻轻冲洗2次，弃去冲洗后即加入10ml营养液，用吸管反复吹散组织小块。
（5）经100目滤网滤入离心管，用羊皮纸封口，1000转/分钟离心5分钟，弃去上层液，确定细胞压积后，以1：300的稀释倍数加入新营养液重新悬浮细胞，每一链霉素瓶加入1ml细胞悬液，放于培养架上，在瓶上方做好标记，置37℃培养。
2．CET制备（可在CEK消化30分钟进行）（1）小心剪开颈部腹侧皮肤。
（2）双手各持一镊子小心他离气管，去除周围的脂肪、结缔组织，尽量少夹伤气管，将整个气管剪入盛有少量BSS的平皿，进一步清除气管外围组织。
（3）用带有塑料吸头的2ml注射器套上气管的一端，反复吸吹BSS，尽量冲洗出气管内的粘液，然后用尖镊子夹住气管中央，从两端分别尽可能薄地剪下完整的气管环于另一盛有BSS的平皿中。
（4）用注射器针头钩起一个完好的气管环加入链霉素瓶中（内含1ml维持液），即可在倒置显微镜下观察纤毛摆动情况，或放37℃培养。