绿色荧光蛋白GFP研究进展

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２００４年６月绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究进展７１

随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因，现有的报告基因主要有：分泌型胎盘磷酸酯酶（ｓ秘Ｐ）、Ｂ一半乳糖苷酶（互丑ｃｚ）、８一葡糖苷酸酶（ＧＵＳ）、萤火虫荧光素酶（ＬＵｃ）等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。最近，一种全新的非酶性报告基因——绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）引起了人们的关注，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。作为报告基因，ＧＦＰ是目前唯一能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，ＧＦＰ既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。最近又发现Ｇ即还是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子，可以跟踪观测第二信使。近来关于ＧＦＰ方面的研究和综述越来越多，但多是针对某一方面的特点或应用，作者将ｃＦＰ基础理论和应用研究进展作一简要综述。

ｌＧＦＰ基础理论研究进展

１．１发展历史

１９６２年蹦ｎ舢ｕ飓等…首先从多管水母属（枷ｒｉａ、ｒｉｃｔｏ．

ｒｉａ）中分离出了ｃＦＰ；１９９２年Ｐｒａｓｌｌｅｒ等ｕ３克隆了ＧＦＰ基因的ｃＤＮＡ，并分析了ＧＦＰ的一级结构；１９９４年ｃｈ址ｅ等ｂ３首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了ＧＦＰ，开创了ＧＦＰ应用研究的先河，之后很快发现ＧＦＰ能在多种异源细胞中表达，ＧＦＰ在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；１９９ｒ７年１０月１８—２２日在美国Ｎｅｗ—Ｊ嘲ｙ专门召开了一次关于ＧＦＰ的国际会议。

１．２ＧＦＰ结构、生化特性、发光机制、光谱特性

１．２．１结构

由正常野生型ｃＦＰ（ｗｔＧ即）的ｃＤＮＡ序列推出的蛋白质一级结构，由２３８个氨基酸残基组成，ｓＤ卜ＰＡＧＥ凝胶电泳测定

其分子量为２７—３０ｌ【Ｄ。晶体学证据Ｈ’表明，ＧＦＰ中央是一个Ｂ罐（ｐ一锄）结构。ＧＦＰ的生色团位于“一６９的六肽内。生色团在翻译后２—４ｈ内自动催化形成，并且ＧＦＰ在合成后需经过一定的折叠过程形成正确的构象后才有功能。ＧＦＰ生色团的形成需要Ｑ，使６６位氨基酸残基的ａ、８键间脱氢，这就意味着ＧｆＰ在严格厌氧条件下不能形成荧光。

１．２．２生化特性

ＧＦＰ在４５０—４９０姗蓝光下最稳定，在３４０—３９０衄或３９５一‰的范围内，会发生光漂白现象；强还原剂如５ｎ蝴Ｎ啦ｓ０４或２ｎ蹦ｆ韬ｑ能使ＧＦＰ转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，ＧＦＰ荧光便会立即恢复；弱还原剂和中度氧化剂（如生物材料的固定脱水剂戊二酸或甲醛等）对ｃＦＰ荧光影响不大，但ＧＦＰ对某些封片指甲油特别敏感；在离体状态下，Ｇ即对高温（７０℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶（链霉蛋白酶ｈＤＩ塘∞除外）有较强抗性，ＧＦＰ荧光在ｐｍ．Ｏ一１２．Ｏ时稳定，在ｐＩｌ５．５—７．０时开始受到影响，在高温（＞７０℃）、极端ｐＨ或胍基氯化物条件下，ＧＦＰ会变性，荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复【５】。

１．２．３发光机制

目前对ＧＦＰ的荧光发光机制还不清楚，Ｍ（Ｈｉ∞等人曾提出一个能量传递模式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。ｃＩＩ砒嘶等怕。对ＧＦＰ进行了光谱分析，结合前人工作提出，ＧＦＰ有两个明显的吸收带，对应于ＧＦＰ的两种不同构象的基态Ａ和Ｂ。基态Ａ对应于３９５姗的吸收峰，基态Ｂ对应于４７５姗的吸收峰，基态Ａ占优势，基态Ｂ的分子数量约是基态Ａ的１，６，两种基态间能缓慢地转换，但激发态（＊）之间的转换很快且发生了质子转移，Ａ。快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过度态Ｉ，质子转移使Ａ。转变成Ｉ。，Ｉ’回迁到基态Ｉ时产生发射峰５０４姗的荧光，构象改变使Ｉ’转变成Ｂ。，由Ｂ。到Ｂ发射荧光而不发生质子转移。目前，对于ＧＦＰ的作用机理较为认同的仅仅是：ＧＦＰ是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。

收稿日期：２００３—０９—２５：修回日期：２００３一１２二１５

基金项目：生活垃圾及农业废气物处理技术与示范工程项目（２００２从６０１０１２—０２）

作者简介：汪恒英（１９７９一），女，硕士生，专业方向为环境工程，ＥｒＩｌ８ｉｌ：ｗｈ∞舀ｒＩｇ＠ｙａｈ∞．Ⅻ；。通讯联系人（ＡｕｔＩｌ∞ｈ∞Ｔｅ叩‘ｘＩｄｅＩｌｃｅ）。

１．２．４光谱特性

ｗ蚓ＦＰ的光谱是所有ＧＦＰ中最复杂的，其荧光激发主峰在３９５ｎｍ，在４７５砌处有一个峰高仅为主峰１，３的小峰。溶液

中，３９５咖激发的荧光发射峰在５０８锄。４７５砌激发的在５０３姗，这类ＧＦＰ的生色团至少由两种不同的化学组分组成，即中性酚和阴离子酚。４７５姗峰随ＧＦＰ分子生色团的去质子化或阴离子生色团的增加而增加，３９５砌则随着ＧＦＰ分子生色团的质子化或中性生色团的增加而增加。野生型ＧＦＰ在室温或低于室温下表达时，Ｇ即几乎都能正确而快速地折叠，但高于室温时，折叠速度却剧烈下降，这种温度的敏感性无碍于水母。因为在它们的生活环境中是不可能遇到温水的，但ＧＦＰ折叠受温度影响却限制了ＧＦＰ的应用；另外，栅具有两个激

发峰的光谱，在应用中也是弊大于利。因此，为拓宽ＧＦＰ的应用，有必要根据不同的用途，对ｗｔＧＦＰ进行适当的改造。

１．３Ｇ卯的改进

目前主要通过以下几个途径得到突变体ＧＦＰ【引：更换ＧＦＰ生色团氨基酸；改变碱基组成；除去ＧＦＰ基因中隐蔽剪接位点；插入植物内含子；更换强启动子等。突变体ＧＦＰ增加了荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠，其荧光特性也得到了改善，甚至出现红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白，大大拓宽了ＧＦＰ研究的领域。以下是ＧＦＰ突变体的部分典型代表。（１）增强型ｃ即：Ｇｌ】ｏｈｏｎ等将Ｓｅｒ６５用ｍ替代，ＰＩ蒯用ＩＪｅｕ替代，使ｃＦＰ的荧光强度提高了３５倍，而且激发后１６—２４ｈ后仍可稳定地测定荧光；（２）人工ＧＦＰ：刻咖ｋｌｌｉｎ等哺１改变了栅基因编码区中８８个密码子中的９２个碱基而用人类

基因组中常用的密码子代替，将ＧＦＰ的荧光强度提高２２倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达；（３）红移荧光蛋白（ＲＳＦＰ）：ＨｅｉＩＩｌ等旧１将ｗｔＧＦＰ中的ｓｅｒ６５用７ｎｌｒ替代，得到突变体．Ｓ６５Ｔ—ＧＦＰ，激发谱中只有一个峰，且红移至４９０姗，用蓝光即可激发ＲＳＦＰ，使之更适于普通荧光显微镜（订ｒｃ）观察；（４）蓝色荧光蛋白（ＢＦＰ）：双突变体Ｙ６６Ｈ，Ｙ１４５一划能在３８１呦光的激发下产生４４５砌的蓝光，这种蓝光还能进一步激发ＧＦＰ产生绿光，即发生荧光共振能量转移（耶回）现象，为不同蛋白质之间及细胞器之间的相互作用研究开辟了更为广阔的视野。

除以上类型的ＧＦＰ突变体以外，人们还通过定点突变得到了一些可用作指示剂的ＧＦＰ突变型如：ｐＨ敏感ＧＦＰ，可被用来测量细胞器或更小颗粒的ｐＨ值，并记录其变化，最近又有报道利用靶人了水母ＧＦＰ基因的丝蛋白昆虫病毒，感染蚕的幼虫，用改造的基因取代了蚕的正常基因，当蚕吐丝时，这种

丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。

２卿应用研究进展

２．１应用特点

ＧＦＰ这一新型报告基因，在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐，其原因就在于它具有以下优点：

（１）检测方便：因为ＧＦＰ荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。

（２）荧光稳定：ＧＦＰ对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；ＧＦＰ在ｐｍ一１２范围内也能正常发光；对高温（７０℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶（链霉蛋白酶Ｐｂ驯雠除外）都有较强抗性。

（３）无毒害：从目前的研究结果来看，ＧｆＰ对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代。

（４）共用性和通用性：首先表现在ＧＦＰ的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是ｃＦＰ没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。

（５）易于构建载体：由于ＧＦＰ分子量较小，仅为２７—３０如，编码ＧＦＰ的基因序列也很短，为２．６ｌ【ｂ，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。

（６）可进行活细胞定时定位观察：对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。通过ＧＦＰ可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛使用的

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