不同脂肪酸甲酯化方法对共轭亚油酸分析的影响
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生方法对 CLA 造成的影响不同, 在衍生过程中 CLA 可能会生成不完全甲酯衍生物, 也可能产生异构化、 氧化或者水解等反应。因此, 必须找到一种最佳的衍 生方法, 以便准确测定 CLA。
本文主要探讨 3种甲酯化方法在不同存在类型 的 CLA 气相色谱分析中的异同, 通过薄层层析法和 气相色谱法测定脂肪酸酯化的程度以及 CLA 甲酯 化后异构体组成的变化。
1 材料与方法 1. 1 实验材料
样品 CLA1(青岛澳海生物有限公司, 主要成分 9c12t - CLA 和 10t12c- CLA ) 、CLA2(上海科宁大中 华营养与健康部, 主要成分 9c12t- CLA 和 10t12cCLA ) 。 1. 2 仪器
6890型气相 色谱 仪 ( Ag ilent 公司 ), F ID 检测 器, CP - S il88石英毛细管柱 ( 100 m 0. 25 mm )。 1. 3 试剂
共轭亚油酸 ( CLA )是亚油酸的位置和几何异构 体。自从 Pariza等人首次分离 并确认 CLA 是一种
收稿日期: 2006- 04- 18 基金项目: 国家自然科学 基金项 目 共轭亚 油酸对 心血 管脂肪代谢的影响研 究 (项目编号为: 30460117) 作者简介: 范 亚 苇 ( 1969- ), 女, 讲 师 /在 读博 士; 主 要 从事食品化学与功能 食品的研究工作。 通讯作者: 邓泽元 教授 /博士
关键词: CLA; 气相色谱法; 甲酯化
E ffect of fatty acid m ethyl esterification m ethods on analysis of conjugated linoleic acids
FAN Y a-w e,i DENG Ze-yuan, YU Y ong-hong, DENG Sheng-guo, LI J ing
( The Key L aboratory of Food Science, M in istry of Education, Departm ent o f Food Sc ience and Eng ineering, N anchang U niversity, 330047 N anchang, China) Abstract: Con jugated lino le ic acids ( CLA ) are the positional and geom etric isom ers o f linole ic ac id. Because o f their b iofunctions, the researches of CLA have draw n much attent ion. T he sim ple and efficien t analytical m ethod of CLA is the gas chrom atog raphy. T he ana ly tica lm ethod can determ ine the ir compos-i t ion and relat ive concentration. The f irst step o f gas chrom atography analysis is the m ethy l esterificat ion o f the fatty ac ids. T he m ethyl esterifica tion m ethods can be classified into three types: acid - cata lyzed m ethod, base- catalyzed m ethod and trim ethylsily ldiazom e thane ( TM S) m ethod. Generally, free fatty acids can be m ethy lated by acid- cata lyzed m ethod or TMS m ethod; trig lycerides can be m ethy lated by acid- ca talyzed m ethod or base- cata lyzed m ethod. T he differences of these three m ethods in ana lysis o f CLA w ere stud ied by thin lay chrom atog raphy ( TLC) and gas chrom atography ( GC) T he results show ed that different m ethyl esterificat ion m ethods gave different levels of m ethy l esterif ication of fatty acids and the composition of isom ers of CLA also changed a fter m ethy l esterif ication. The concentration of fatty acids in the sam e CLA by acid- cata lyzed m ethod w as 73. 34% , and TM S m ethod w as 82. 47% . T he concentration o f tt- CLA by acid- catalyzed m ethod w as 24. 66% . K ey w ords: con jugated linole ic acid; gas chrom atog raphy; m ethy l esterification
1. 5 薄层层析法分离甲酯化脂肪酸 取甲酯化后的滤液, 用氮气吹干后, 加氯仿, 以
正己烷 乙醚 乙酸 ( 85 15 1) 为展开剂, 在硅 胶 G 板做薄板层析, 分离纯化甲酯化 CLA样品, 用 2, 7二氯荧光黄显色, 在紫外灯下刮下有甲酯化 CLA 的 硅胶, 用氯仿洗出, 氮气吹干, 正己烷溶解后上气相 色谱仪分析 [ 3] 。 1. 6 气相色谱分析条件
抗癌剂以来, 关于 CLA 生理活性的研究就成为人们 关注的焦点 [ 1] 。国外的研究表明, CLA 具有抑制癌 症、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化、抗氧化及有效防 止免疫刺激的分解代谢等作用 [ 2] 。
目前, 国内在 CLA 作用方面的研究已取得了很 大的进展。气相色谱法是分析 CLA 的一种简便而有 效的方法, 通过分析可以确定 CLA 的组成和含量。 油脂中脂肪酸特别是长碳链脂肪酸一般不直接进行
CLA 样品甲酯化后的 气相色谱图见 图 3, CLA 样品中脂肪酸百分含量见表 1。
图 3 样品气相色谱图 ( A 463 标 样 B 酸 法 甲 酯化 的 CLA 1 M E C TM S 甲 酯 化 的 CLA 1 M E D 酸法甲酯化的 CLA 2 M E E 碱法甲酯化的 CLA 1 M E
2007年第 32卷第 1期
中 国油脂
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气相色谱分析, 须先将它们衍生为易挥发的甲酯再进 行分析。若直接进行分析, 柱温很高, 高温固定相难 以选择, 色谱峰易拖尾, 保留时间不重复, 有时有假峰 出现等。脂肪酸的甲酯化方法可分为 3大类, 酸催化 法、碱催化法和三甲基硅重氮甲烷 ( TM S)法。一般游 离脂肪酸的甲酯化可采用酸催化或 TM S法, 三甘油 酯型的脂肪酸可采用酸催化或碱催化法。不同的衍
程序 升 温 过 程: 45 时 保 持 3 m in, 然 后 以 13 /m in的 升 温 速 率 将 温 度 升 至 175 , 保 持 27 m in, 再 以 4 /m in 的 升 温 速 率 将 温 度 升 至 215 , 保持 5 m in, 载气为氢气 [ 3] 。 2 结果与分析 2 1 薄层层析
摘要: 共轭亚油酸 ( CLA )是亚油酸的位置和几何异构体, 因其具有多种生物学功能而成为人们 关注的焦点。气相色谱法是分析 CLA 的一种简便而有效的方法, 通过分析可以确定 CLA 的组成 和含量。气相色谱法分析 C IA 先涉及脂肪酸的甲酯化, 脂肪酸的甲酯化方法可分为 3大类, 酸催 化、碱催化和三甲基硅重氮甲烷 ( TM S) 法。一般游离型脂肪酸的甲酯化可采用酸催化或 TMS 法, 而三甘油酯型的脂肪酸可采用酸催化或碱催化法。主要探讨 3种甲酯化方法在不同结构的 CLA 气相色谱分析中的异同, 通过薄层层析 ( TLC ) 和气相色谱 ( GC ) 测定, 发现甲酯化过程中脂肪酸酯 化的程度各不相同, CLA 甲酯化后组成发生了异构化。结果表明, CLA 经过酸催化法后得脂肪酸 含量为 73. 34% , 而 TM S法为 82. 47% ; 酸催化法后反反 CLA( tt- CLA ) 含量为 24. 66% 。
图 2 TM S甲酯化和酸法甲酯化样品的薄层层析图
从图 2可以看出: 经过 TM S 法甲酯化后, CLA1 全部转变为甲酯, 而 CLA 2几乎没有得到甲酯; 酸法 甲酯化后, CLA1和 CLA2都有部分转化为甲酯, 但
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中国油脂
2007年第 32卷第 1期
转化不完全。 2 2 气相色谱分析
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中国油脂
文章编号: 1003- 7969( 2007) 01- 0052- 04
中图分类号: O623. 12
2007年第 32卷第 1期பைடு நூலகம்
文献标识码: A
不同脂肪酸甲酯化方法对共轭亚油酸分析的影响
范亚苇, 邓泽元, 余永红, 邓胜国, 李 静
(食品科 学教育部重点实验室, 南昌大学食品科学与工程系, 330047 南昌市 )
三甲基硅重氮甲烷 ( TM S- DZM ) 、正己烷、无水 甲醇、氯仿等均为色谱纯, H C l甲醇溶液, 乙酸甲酯, 苯 ( 分析纯 ) 。脂肪酸 463标样和 CLA 混合物标样 ( NU - CHEK - PREP 公司 ) 。 1. 4 CLA 甲酯化 1 4 1 碱法甲酯化 样品 2 mg溶于 1. 5 mL 正己烷 中, 加乙酸甲酯 40 L 振荡, 再加入 100 L 溶有甲醇 钠的甲醇溶液在室温下反应 20 m in, 冷冻 10m in后加 60 L 草酸, 无水硫酸钠过滤得滤液备用 [ 3] 。 1 4 2 酸法甲酯化 取 5% 的 H C l甲醇溶液 4 mL、 苯 1 mL, 加入 CLA 样品 1滴, 混匀。在 80 下甲酯 化 1 h。冷却后加 1 mL水, 3 m L正己烷, 振荡 1 m in, 收集上层正己烷层, 无水硫酸钠过滤得滤液备 用 [ 4] 。 1 4 3 三甲基硅重氮甲烷甲酯化 取甲醇溶液 0. 5 mL、苯 0. 5 mL, 加入 CLA样品 1滴, 混和均匀。加 入三甲基硅重氮甲烷 ( TM S - DZM ) 0. 2 m L, 剧烈振 荡, 室温下反 应 30 m in, 加入 1滴乙 酸, 2 mL 正己 烷, 2 mL 水和 2滴 0. 5 m o l/L 的 N aOH, 离心取正己 烷层, 无水硫酸钠过滤得滤液备用 [ 5] 。
1 9 c12 t- CLA 2 10 t12 c- CLA 3 cc- CLA 4 tt- CLA )
表 1 CLA中脂肪酸 组成 (% )
脂肪酸
CLA 1 酸法甲酯化 TM S 法
CLA 2 碱法甲酯化 酸法甲酯化
CLA 经 薄 板 层 析 后, 喷 20% 的 硫 酸, 置 于 180 电热板上加热使脂肪酸碳化, 扫描获得图 1、 图 2薄板层析图谱。
图 1 碱法甲酯化前后样品的薄层层析图 ( CE 胆固醇酯 M E 甲 酯 TG 甘油 三酯 FFA 游离脂 肪酸 O 原点, 下同 )
从图 1可以看出: CLA1以游离脂肪酸的形式存 在, CLA2以甘油三酯的形式存在, 经过碱法甲酯化 后, CLA 1几乎没有得到甲酯, 而 CLA 2全部转化为 甲酯。
本文主要探讨 3种甲酯化方法在不同存在类型 的 CLA 气相色谱分析中的异同, 通过薄层层析法和 气相色谱法测定脂肪酸酯化的程度以及 CLA 甲酯 化后异构体组成的变化。
1 材料与方法 1. 1 实验材料
样品 CLA1(青岛澳海生物有限公司, 主要成分 9c12t - CLA 和 10t12c- CLA ) 、CLA2(上海科宁大中 华营养与健康部, 主要成分 9c12t- CLA 和 10t12cCLA ) 。 1. 2 仪器
6890型气相 色谱 仪 ( Ag ilent 公司 ), F ID 检测 器, CP - S il88石英毛细管柱 ( 100 m 0. 25 mm )。 1. 3 试剂
共轭亚油酸 ( CLA )是亚油酸的位置和几何异构 体。自从 Pariza等人首次分离 并确认 CLA 是一种
收稿日期: 2006- 04- 18 基金项目: 国家自然科学 基金项 目 共轭亚 油酸对 心血 管脂肪代谢的影响研 究 (项目编号为: 30460117) 作者简介: 范 亚 苇 ( 1969- ), 女, 讲 师 /在 读博 士; 主 要 从事食品化学与功能 食品的研究工作。 通讯作者: 邓泽元 教授 /博士
关键词: CLA; 气相色谱法; 甲酯化
E ffect of fatty acid m ethyl esterification m ethods on analysis of conjugated linoleic acids
FAN Y a-w e,i DENG Ze-yuan, YU Y ong-hong, DENG Sheng-guo, LI J ing
( The Key L aboratory of Food Science, M in istry of Education, Departm ent o f Food Sc ience and Eng ineering, N anchang U niversity, 330047 N anchang, China) Abstract: Con jugated lino le ic acids ( CLA ) are the positional and geom etric isom ers o f linole ic ac id. Because o f their b iofunctions, the researches of CLA have draw n much attent ion. T he sim ple and efficien t analytical m ethod of CLA is the gas chrom atog raphy. T he ana ly tica lm ethod can determ ine the ir compos-i t ion and relat ive concentration. The f irst step o f gas chrom atography analysis is the m ethy l esterificat ion o f the fatty ac ids. T he m ethyl esterifica tion m ethods can be classified into three types: acid - cata lyzed m ethod, base- catalyzed m ethod and trim ethylsily ldiazom e thane ( TM S) m ethod. Generally, free fatty acids can be m ethy lated by acid- cata lyzed m ethod or TMS m ethod; trig lycerides can be m ethy lated by acid- ca talyzed m ethod or base- cata lyzed m ethod. T he differences of these three m ethods in ana lysis o f CLA w ere stud ied by thin lay chrom atog raphy ( TLC) and gas chrom atography ( GC) T he results show ed that different m ethyl esterificat ion m ethods gave different levels of m ethy l esterif ication of fatty acids and the composition of isom ers of CLA also changed a fter m ethy l esterif ication. The concentration of fatty acids in the sam e CLA by acid- cata lyzed m ethod w as 73. 34% , and TM S m ethod w as 82. 47% . T he concentration o f tt- CLA by acid- catalyzed m ethod w as 24. 66% . K ey w ords: con jugated linole ic acid; gas chrom atog raphy; m ethy l esterification
1. 5 薄层层析法分离甲酯化脂肪酸 取甲酯化后的滤液, 用氮气吹干后, 加氯仿, 以
正己烷 乙醚 乙酸 ( 85 15 1) 为展开剂, 在硅 胶 G 板做薄板层析, 分离纯化甲酯化 CLA样品, 用 2, 7二氯荧光黄显色, 在紫外灯下刮下有甲酯化 CLA 的 硅胶, 用氯仿洗出, 氮气吹干, 正己烷溶解后上气相 色谱仪分析 [ 3] 。 1. 6 气相色谱分析条件
抗癌剂以来, 关于 CLA 生理活性的研究就成为人们 关注的焦点 [ 1] 。国外的研究表明, CLA 具有抑制癌 症、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化、抗氧化及有效防 止免疫刺激的分解代谢等作用 [ 2] 。
目前, 国内在 CLA 作用方面的研究已取得了很 大的进展。气相色谱法是分析 CLA 的一种简便而有 效的方法, 通过分析可以确定 CLA 的组成和含量。 油脂中脂肪酸特别是长碳链脂肪酸一般不直接进行
CLA 样品甲酯化后的 气相色谱图见 图 3, CLA 样品中脂肪酸百分含量见表 1。
图 3 样品气相色谱图 ( A 463 标 样 B 酸 法 甲 酯化 的 CLA 1 M E C TM S 甲 酯 化 的 CLA 1 M E D 酸法甲酯化的 CLA 2 M E E 碱法甲酯化的 CLA 1 M E
2007年第 32卷第 1期
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气相色谱分析, 须先将它们衍生为易挥发的甲酯再进 行分析。若直接进行分析, 柱温很高, 高温固定相难 以选择, 色谱峰易拖尾, 保留时间不重复, 有时有假峰 出现等。脂肪酸的甲酯化方法可分为 3大类, 酸催化 法、碱催化法和三甲基硅重氮甲烷 ( TM S)法。一般游 离脂肪酸的甲酯化可采用酸催化或 TM S法, 三甘油 酯型的脂肪酸可采用酸催化或碱催化法。不同的衍
程序 升 温 过 程: 45 时 保 持 3 m in, 然 后 以 13 /m in的 升 温 速 率 将 温 度 升 至 175 , 保 持 27 m in, 再 以 4 /m in 的 升 温 速 率 将 温 度 升 至 215 , 保持 5 m in, 载气为氢气 [ 3] 。 2 结果与分析 2 1 薄层层析
摘要: 共轭亚油酸 ( CLA )是亚油酸的位置和几何异构体, 因其具有多种生物学功能而成为人们 关注的焦点。气相色谱法是分析 CLA 的一种简便而有效的方法, 通过分析可以确定 CLA 的组成 和含量。气相色谱法分析 C IA 先涉及脂肪酸的甲酯化, 脂肪酸的甲酯化方法可分为 3大类, 酸催 化、碱催化和三甲基硅重氮甲烷 ( TM S) 法。一般游离型脂肪酸的甲酯化可采用酸催化或 TMS 法, 而三甘油酯型的脂肪酸可采用酸催化或碱催化法。主要探讨 3种甲酯化方法在不同结构的 CLA 气相色谱分析中的异同, 通过薄层层析 ( TLC ) 和气相色谱 ( GC ) 测定, 发现甲酯化过程中脂肪酸酯 化的程度各不相同, CLA 甲酯化后组成发生了异构化。结果表明, CLA 经过酸催化法后得脂肪酸 含量为 73. 34% , 而 TM S法为 82. 47% ; 酸催化法后反反 CLA( tt- CLA ) 含量为 24. 66% 。
图 2 TM S甲酯化和酸法甲酯化样品的薄层层析图
从图 2可以看出: 经过 TM S 法甲酯化后, CLA1 全部转变为甲酯, 而 CLA 2几乎没有得到甲酯; 酸法 甲酯化后, CLA1和 CLA2都有部分转化为甲酯, 但
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2007年第 32卷第 1期
转化不完全。 2 2 气相色谱分析
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中国油脂
文章编号: 1003- 7969( 2007) 01- 0052- 04
中图分类号: O623. 12
2007年第 32卷第 1期பைடு நூலகம்
文献标识码: A
不同脂肪酸甲酯化方法对共轭亚油酸分析的影响
范亚苇, 邓泽元, 余永红, 邓胜国, 李 静
(食品科 学教育部重点实验室, 南昌大学食品科学与工程系, 330047 南昌市 )
三甲基硅重氮甲烷 ( TM S- DZM ) 、正己烷、无水 甲醇、氯仿等均为色谱纯, H C l甲醇溶液, 乙酸甲酯, 苯 ( 分析纯 ) 。脂肪酸 463标样和 CLA 混合物标样 ( NU - CHEK - PREP 公司 ) 。 1. 4 CLA 甲酯化 1 4 1 碱法甲酯化 样品 2 mg溶于 1. 5 mL 正己烷 中, 加乙酸甲酯 40 L 振荡, 再加入 100 L 溶有甲醇 钠的甲醇溶液在室温下反应 20 m in, 冷冻 10m in后加 60 L 草酸, 无水硫酸钠过滤得滤液备用 [ 3] 。 1 4 2 酸法甲酯化 取 5% 的 H C l甲醇溶液 4 mL、 苯 1 mL, 加入 CLA 样品 1滴, 混匀。在 80 下甲酯 化 1 h。冷却后加 1 mL水, 3 m L正己烷, 振荡 1 m in, 收集上层正己烷层, 无水硫酸钠过滤得滤液备 用 [ 4] 。 1 4 3 三甲基硅重氮甲烷甲酯化 取甲醇溶液 0. 5 mL、苯 0. 5 mL, 加入 CLA样品 1滴, 混和均匀。加 入三甲基硅重氮甲烷 ( TM S - DZM ) 0. 2 m L, 剧烈振 荡, 室温下反 应 30 m in, 加入 1滴乙 酸, 2 mL 正己 烷, 2 mL 水和 2滴 0. 5 m o l/L 的 N aOH, 离心取正己 烷层, 无水硫酸钠过滤得滤液备用 [ 5] 。
1 9 c12 t- CLA 2 10 t12 c- CLA 3 cc- CLA 4 tt- CLA )
表 1 CLA中脂肪酸 组成 (% )
脂肪酸
CLA 1 酸法甲酯化 TM S 法
CLA 2 碱法甲酯化 酸法甲酯化
CLA 经 薄 板 层 析 后, 喷 20% 的 硫 酸, 置 于 180 电热板上加热使脂肪酸碳化, 扫描获得图 1、 图 2薄板层析图谱。
图 1 碱法甲酯化前后样品的薄层层析图 ( CE 胆固醇酯 M E 甲 酯 TG 甘油 三酯 FFA 游离脂 肪酸 O 原点, 下同 )
从图 1可以看出: CLA1以游离脂肪酸的形式存 在, CLA2以甘油三酯的形式存在, 经过碱法甲酯化 后, CLA 1几乎没有得到甲酯, 而 CLA 2全部转化为 甲酯。