重组植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶活力测定实验

重组植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶活力测定实验
一、实验目的
了解原核表达系统
熟悉并掌握粗酶液的制备方法
熟悉并掌握谷氨酸脱羧酶活力的测定方法
熟悉并掌握超声破碎仪及U-V1100紫外可见分光光度计使用方法
二、实验原理
γ-氨基丁酸（GABA）作为一种非蛋白氨基酸，是目前研究较为深入的哺乳动物脑组织一种重要的抑制性神经递质，具有一系列的生理功能，例如降血压功能、治疗癫痫、抗疲劳、提高免疫力等。

谷氨酸脱羧酶（GAD,EC4.1.1.15）是一种磷酸吡哆醛（PLP）类酶，能专一催化L-谷氨酸脱羧成为γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。

催化效率——即酶的活力是酶的重要参数，研究酶的活力是研究酶性质及应用的基础。

本实验通过测定谷氨酸脱羧酶催化产物γ-氨基丁酸产率来定义谷氨酸催化活力。

谷氨酸脱羧酶催化反应式如下：
L-谷氨酸谷氨酸脱羧酶（GAD）γ-氨基丁酸（GABA）GAD现行测定方法及优缺点
测定方法优点缺点
HPLC法准确灵敏度高操作复杂、测定时间较长氨基酸自动分析仪法稳定操作简单仪器使用复杂、昂贵
纸层析和薄层层析法方便简单稳定性差、适合定性测量
Berthelot比色法灵敏度高、方便简单有游离氨干扰
毛细管电泳法耗材少，环境污染小重现性较差
根据样品的特性及实验的需要，本实验采用Berthelot法测定反应液中GABA。

GABA的测定方法
采用Berthelot法，该方法利用苯酚和次氯酸钠与氨基反应生成蓝绿色物质(次氯酸钠氧化苯酚生成醌，醌和氨基反应生成蓝绿色物质)。

Berthelot法对GABA（ω-氨基酸）的响应高，而对L-谷氨酸（α-氨基酸）响应低，所以用Berthelot法可以快速、高灵敏度测定出催化反应产物中的GABA。

通过测定一定时间反应液中的GABA的吸光度值从而得到GABA的浓度，最终计算出谷氨酸脱羧酶的活力。

三、实验材料和主要仪器
1、仪器
MIKRO 220R 2205型低温冷冻离心机
UV-1100型紫外可见分光光度计
水浴锅ZHWY-110X
AB104-N型电子分析天平
FS-250N型超声破碎仪
2、主要器皿
100mL容量瓶、烧杯、样品瓶、5mL试管、5mL离心管、10mL离心管、50mL离心管
3、试剂和材料
γ-氨基丁酸（GABA）标准品（sigma公司）
L-谷氨酸钠（味精）
磷酸盐缓冲液（PBS）：8g/L NaCl,0.2g/L KCl,1.42g/L Na2HPO4,0.27g/L KH2PO4,加入浓盐酸调节pH至7.4
Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH4.8，含0.2MNa2HPO4，0.1M柠檬酸，20mL）：0.2M Na2PO4
9.86mL,0.1M柠檬酸10.14mL混合。

6%苯酚溶液（需要现配）
次氯酸钠溶液
0.2mol/L硼酸钠缓冲液（pH9.0）
4、培养基
Luria-Bertani（LB）培养基
含1%胰蛋白胨，1%氯化钠，0.5%YEAST EXTRACT（酵母粉）
5、菌株
已转入植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌BL21。

四、实验步骤
1、重组工程菌的活化与转接
将甘油保藏的工程菌接入有AMP（100μg/mL）的10mL LB培养基中过夜活化。

将过夜活化的工程菌以5%的接种量转接入20mL LB培养基中待其生长至OD600=0.5时加入诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导8h。

同时做空载体对照组的活化与转接。

2、粗酶液的制备
取诱导后的菌液于50mL离心管中，以6000 r/min离心10 min，去上清，菌体经PBS 缓冲液洗涤后重悬于5 mL的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，并利用超声细胞破碎仪破碎菌
体(200 w，工作2 s间歇1 s，200次)。

破碎后的菌液离心后取上清即是粗酶液。

同时对空载对照组进行超声波破碎。

3、GABA标准曲线的制作
取1.0mg/mL标准GABA溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于6支试管中，加蒸馏水补足至1.0mL，再依次加入400μL 0.2mol/L硼酸钠缓冲液（pH9.0）, 1.0mL 6%(v/v)苯酚和1.0mL次氯酸钠溶液，充分振荡后，沸水浴中反应10min，迅速在冰浴中冷却显色20min，待出现蓝绿色后加入60%（v/v）乙醇溶液2.0mL，最后在643.5nm处测定吸光度。

注意：GABA标准溶液4℃保存。

4、GAD酶活力的测定
采用比色法。

首先配制Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH 4.8，含0.02M底物L-谷氨酸钠, 0.01mM辅酶PLP)，取400μL底物溶液和200μL粗酶液在37℃反应30min，煮沸，加入400μL 0.2mol/L硼酸钠缓冲液（pH9.0）终止反应；再加入1.0mL 6%(v/v)苯酚和1.0mL次氯酸钠溶液，充分振荡后，沸水浴中反应10min，迅速在冰浴中冷却显色20min，待出现蓝绿色后加入60%（v/v）乙醇溶液2.0mL，最后在643.5nm处测定吸光度。

以底物溶液中不加酶液加入等量蒸馏水为对照组。

酶反应体系中GABA的量以标准曲线确定，一个酶活力单位（U）定义为在测定条件下每分钟产生1μmol GABA所需的酶量。

五、结果计算及讨论分析
1、GABA标准曲线的制作
表1 GABA标准曲线制作
管号 1 2 3 4 5 6
1.0mg/mL标准GABA（mL）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
OD643
2、GAD酶活力的测定
总酶活A（U/mL）的计算
根据标准曲线计算样品中的GABA含量，再根据反应时间计算出粗酶液酶活A （U/mL）。