健康仔猪肠道内抗逆性乳酸菌的选育

健康仔猪肠道内抗逆性乳酸菌的选育

邱进杰1,熊　焰1,杨　智2

(1.四川农业大学动物医学院,四川雅安625014;2.四川七环公司良种猪场,四川温江611100)

中图分类号:S852.6 文献标识码:B 文章编号:052926005(2008)0420086201

仔猪腹泻在兽医临床上十分普遍,它严重的影响和制约着仔猪的存活率及养殖者的经济收入。市场上治疗仔猪腹泻的药物很多,但存在药物残留问题。研究开发无毒、无副作用和无残留的益生菌制剂已成为热点课题。1998年美国动物饲粮管理协会(AA FCO)年鉴公布了43种可用作益生素的菌种,其中半数以上是乳酸菌(lactic acid bacite2 ria)[1]。因此,乳酸菌在益生菌制剂的研究和生产中扮演着重要的角色。本试验的目的是从健康仔猪的新鲜粪便中分离、选育出抗逆性(耐酸、耐胆盐)强的乳酸菌菌株,用于防治仔猪肠道疾病。

1　材料与方法

1.1　样品　健康乳猪新鲜粪便,采自四川多个规模化养猪场。

1.2　培养基　增菌培养基、分离培养基和生化培养基,参见文献[2]配制。

1.3　细菌的分离鉴定　按常规方法进行细菌的分离鉴定[324]。

1.4　耐胆盐试验　取24h乳酸菌新鲜培养物,用灭菌生理盐水作10-4～10-7稀释(选取一适宜的稀释度),用微量加样器吸取0.1mL乳酸菌稀释液均匀涂布于胆盐浓度分别为0%,0.2%,0.3%, 0.4%,0.5%MRS营养琼脂平皿上,于37℃温箱中培养24～48h,进行菌落计数。每个菌株作3个平行。计算存活率。1.5　耐酸试验　将24h乳酸菌培养物按1%(V/V%)接种于p H

2.5的MRS肉汤中,接种后于37℃培养箱中培养。分别在0h和8h,取出适量的培养物用灭菌生理盐水进行梯度稀释至10-3～10-5(选取一适宜的稀释度),用微量加样器吸取0.1mL菌液于MRS营养琼脂平皿上均匀涂布,置入37℃培养箱中培养24～48h,进行菌落计数。每个菌样做3个平行。计算存活率s=h8/h0。

2　结果

2.1　细菌的分离鉴定　本试验分离到5株乳酸菌,编号为6#、7#、9#、19#、22#,根据革兰氏染色镜检和相关生化试验指标,参见《伯杰细菌鉴定手册》[3],最终鉴定为:菌株6#为乳酸乳杆菌,7#为乳链球菌,菌株9#为懒惰乳杆菌,菌株19#为嗜酸乳杆菌,菌株22#为嗜酸乳杆菌。

2.2　耐胆盐试验　菌株6#、7#、19#、22#能耐高达0.3%以上的胆盐,乳酸菌在不同胆盐浓度下的存活率见图1

。

表1　菌株6#、7#、19#、22#在pH2.5的MRS肉汤中培养8h活菌数及存活率菌号时间平皿1活菌数平皿2活菌数平皿3活菌数平均活菌数(h)8h存活率(s=h s/h0) 6#0h 2.7×108 3.0×108 2.2×108 2.6×108167.63% 8h 4.0×108 4.5×108 4.4×108 4.3×108 7#0h8.2×1078.1×1078.1×1078.1×1070.49% 8h 5.0×106 3.0×106 4.0×106 4.0×106 19#0h 2.6×107 2.1×107 2.4×107 2.0×107106.84% 8h 2.5×107 2.4×107 2.6×107 2.5×107 22#0h 3.2×107 3.5×107 3.1×107 3.1×10790.03% 8h 2.7×107 2.7×107 2.9×107 2.8×107

注:菌株6#稀释至10-7,菌株7#、19#、22#稀释至10-5。

收稿日期:2006208210

通讯作者:熊焰,E2mail:xyan2004@hot 2.3　耐酸试验　耐酸结果见表1:菌株6#、7#、19#、22#在p H2.5的MRS肉汤中培养8h,其存活率分别为167.63%、0.49%、106.84%、90.03%。

68中国兽医杂志2008年(第44卷)第4期 Chinese Journal of Veterinary Medicine

超抗原———在养殖业中应被重视的致病因子刘晓宁1,何世成2,孔先坤3,胡东健4,谭　双4,余旭平4

(1.杭州余杭区农业局物流中心,浙江杭州311112;2.湖南省兽医总站,湖南长沙410007;

3.杭州余杭区畜牧兽医局,浙江杭州311100;

4.浙江大学动物科学院,浙江杭州310029)

中图分类号:S852.4 文献标识码:E 文章编号:052926005(2008)0420087203

超抗原是指浓度低于一般抗原(conventional antigens)即能刺激带有特殊TcR2Vβ(或TcR2Vγ)的T细胞大量增生,并从而改变机体免疫系统自身稳定性的一类蛋白质抗原分子。它主要是一些细菌的外毒素或逆转录病毒的基因产物。超抗原的概念在1989年由White提出以后,其强大的T细胞激活作用,在人医学界和免疫学界引起了巨大的反响,并迅速成为了20世纪90年代世界性研究的前沿课题之一。介绍如下。

1　种类　超抗原可分为内源性超抗原和外源性超抗原两大类。内源性超抗原主要是指某些逆转录病毒的基因产物,现在研究的比较详细的是逆转录小鼠乳腺瘤病毒(MM TV)编码的一种称为次要淋巴刺激(ML S)抗原,亦称病毒性抗原。外源性超抗原主要是指某些细菌产生的外毒素,因此也称为细菌性超抗原。目前研究所发现的细菌性超抗原主要有:①葡萄球菌类:葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC123、SED、SEE)、表皮剥脱毒素(EXF A、B)、毒性休克综合征毒素21(TSST21);②链球菌类:

收稿日期:2007203223

作者简介:刘晓宁(19822),女,硕士,从事动物检疫工作

通讯作者:余旭平,电话:0571286971096;E2mail:yuxp@zju. 链球菌M蛋白(M P)、致热外毒素(SPE)A、B、C。

另外,根据所激活的细胞种类,超抗原又可分为T细胞超抗原(T2SAg)和B细胞超抗原(B2SAg)。T2SAg可激活大量的T细胞,而B2SAg则主要刺激B细胞的大量增殖。

2　作用机理以及与普通抗原和有丝分裂源的差异　我们知道,异种抗原活化T细胞的机制是免疫应答的中心环节,T细胞受体(TCR)2抗原肽2M HC三分子复合体是机体特异性免疫应答的分子基础,机体的免疫特异性主要取决于TCR对抗原肽和M HC复合结构的识别,即抗原肽2M HC复合分子对带有特异TCR受体结构的T细胞作克隆性选择。成熟T细胞的TCR由α和β两条链组成,每条链均有两个功能区,即N端的可变(V)区,C端的恒定(C)区。V区是特异性抗原的结合部位,具有高度可变性。V区含众多的基因片段,α链的V区基因包括多个Vα、Jα等片段,β链的V区基因包括多个Vβ、Dβ、Jβ等片段。在细胞发育过程中,这些基因片段经过重排,形成上千万个特异性不同的TCR基因,编码为数极多的TCR,以适应不同细胞识别各种不同的特异性抗原。

普通外源性抗原在激活CD4+T细胞的过程中,首先是结合到A PC的表面,然后通过吞噬、胞吞

3　讨论

乳酸菌制剂以口服的方式饲喂动物,必须具备耐受胃内低p H和肠道内较高胆盐的能力。初生仔猪虽有胆汁分泌,但是分泌量很少,出生后3周内胆汁增加缓慢,一般在0.03%～0.3%范围内波动[5],菌株6#、7#、19#、22#能耐高达0.3%以上的胆盐,与文献[627]报告的菌株相比,菌株6#、7#、19#、22#是胆盐耐受能力较强的乳酸菌菌株。作者研究结果显示[7],仔猪胃内p H维持在3左右,小肠在4～5,大肠在5以上。菌株6#、19#、22#在p H2.5的环境中作用8h能达到90%以上的存活率,完全能适应仔猪胃肠道酸性环境。作为益生菌的乳酸菌必须是那些被公认为安全的微生物(GRAS微生物),并且要有抗胃肠道不利环境的能力。以上试验结果表明,菌株6#、19#、22#是耐酸、耐胆盐能力较强的菌株,符合农业部1999年公布的可用于生产上的安全菌种。

利用乳酸菌制剂调节仔猪肠道菌群,抑制病原细菌的生长,对降低药残,改善猪肉品质,无疑是一理想的途径,也是今后国内外在防治猪胃肠道疾病及提高猪自身免疫力的发展方向。

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