聚乙二醇化蛋白质类药物的结构分析方法
聚乙二醇修饰小分子药物的修饰位点（氨基羧基疏基二硫键糖基）
聚乙二醇修饰小分子药物的修饰位点（氨基羧基疏基二硫键糖基）鉴于PEG修饰对药物性质产生的巨大影响，PEG修饰成为药物研发以及已上市药物药效改善的重要途径。
那么，如何进行PEG修饰则成为重中之重。
首先，需要选择合适的PEG来进行分子修饰。
对修饰剂的选择主要考虑以下5个方面：(1)PEG相对分子质量（Mr）的选择要综合考虑生物活性和药代动力学两方面的因素。
应用过大的PEG修饰蛋白药物会导致药物丧失绝大部分的生物活性。
而使用低Mr (<20000)的PEG修饰蛋白药物，修饰后的蛋白药物较原型药物在生物活性和药代动力学性质上没有本质改变，所以，一般选择在40000- 60000范围内的PEG作为修饰。
(2)修饰位点的选择要根据蛋白质构效关系分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。
常用的修饰位点有氨基修饰、羧基修饰和巯基修饰；(3)PEG修饰剂与氨基酸反应的特异性依赖于修饰剂的化学性质与修饰位点的选择。
目前常见修饰剂见表1；(4)PEG修饰剂的水解稳定性和反应活性取决于活化基团的稳定性和修饰反应的条件控制，特别是pH的控制。
一般来说，PEG修饰剂的反应活性高，则其稳定性就差，容易水解；(5)PEG修饰后的蛋白活性、毒性和抗原性与PEG的大小和修饰类型有关。
一般随着PEG 的Mr的增大，蛋白的活性损失也逐渐增加，另外不同的PEG修饰剂对蛋白的生物活性影响不同。
最后，选择合适的蛋白质氨基酸残基位点或小分子药物位点进行定点修饰。
用活化后的PEG对合适的蛋白质氨基酸残基进行定点修饰，从而改善天然蛋白质的疗效。
蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一，给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。
根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点，科研人员在用PEG进行修饰时，根据蛋白质的构效关系进行分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白药物除具有PEG修饰所带来的优良性质外依然具有较高的生物活性。
聚乙二醇修饰蛋白的快速分离与纯化
第37卷 第4期2009年4月西北农林科技大学学报(自然科学版)Jo ur nal of N o rthwest A&F U niver sity(N at.Sci.Ed.)Vo l.37N o.4A pr.2009聚乙二醇修饰蛋白的快速分离与纯化*黄 静,杨宇峰,卞慧芳,郁正艳,徐 进,吴自荣(华东师范大学生命科学学院,上海200062)[摘 要] 目的 建立聚乙二醇修饰蛋白的快速分离纯化方法。
方法 以4种聚乙二醇化药用蛋白为研究对象,采用阳离子交换树脂进行纯化。
纯化条件:H ipr ep16/10CM Sepharo se FF(1mL)预装柱;流动相:A液为20 mmo l/L pH4.0的醋酸缓冲液;B液为A液中加入1mol/L NaCl;B液以0~100%离子强度线性梯度洗脱100min,流速0.2mL/min,波长280nm检测,收集各洗脱峰。
结果 一步纯化可将单点修饰产物与聚乙二醇、多点修饰产物以及未修饰蛋白分离开来,单点修饰产物经SD S PA GE检测呈单一条带,经质谱检测其相对分子质量与预期相符。
结论 所建立的纯化方法可快速分离纯化聚乙二醇修饰蛋白。
[关键词] 聚乙二醇;药用蛋白;分离与纯化[中图分类号] R914.5;R94[文献标识码] A[文章编号] 1671 9387(2009)04 0191 06Rapid isolation and purification of pegylated proteinsH UA NG Jing,YAN G Yu feng,BIA N Hui fang,YU Zheng yan,XU Jin,WU Zi rong(S chool of L if e S cience,Ea st China N ormal Univ ersity,S hang hai200062,China)Abstract: Objectiv e T he study established a rapid iso lation and purificatio n metho d for peg ylated pro teins. M ethod To purify4kinds of pegy lated pharm aceutical proteins,cation ion exchange chro ma to graphy w as used.T he purification w as carr ied o ut by using a H ipr ep16/10CM Sepharo se FF(1mL) column w ith the mixture of(A)20mmo l/L pH4.0so dium acetate buffer and(B)20m mol/L pH4.0sodi um acetate buffer containing1mol/L N aCl as mobile phase in g radient mo de.B buffer w as eluted fro m0-100%in100m in,at a flow rate o f0.2mL/min and the detection w avelength w as280nm.The eluates w ere collected and assay ed by SDS PA GE. Result The purified m ono pegy lated proteins w ere achieved from the modified mixture o n catio n ex chang e chrom atog raphy by one step purification procedure.T he m ono pegy lated pro teins show ed sing le band on SDS PAGE gel.T he mo lecular w eights of4kinds of monopeg ylated pro teins w ere determ ined by M ALDI TOF m ass spectr ometry and the r esults w er e just as ex pected. Con clusion T his developed method w as suitable for rapid pur ification of pegylated proteins.Key words:poly(ethylene glycol);pharmaceutical protein;isolation and purificatio n20世纪70年代Davis等的开拓性工作,使聚乙二醇(PEG)修饰的蛋白质和多肽在生物医学和生物技术等诸多领域得到越来越广泛的应用[1]。
蛋白质的PEG化学修饰
bin at Cys293(beta):correlation be-
tween the colligative properties of the
PEGylated protein and the length of
蛋白质上的修饰基团多为亲核性的, 其 活 性 的 顺 序 是 :巯 基 >α -氨 基 >ε -氨 基>羟 基 。所 以 可 以 选 取 能 够 特 异 性 PEG修 饰 剂 对 数 目 稀 少 巯 基 进 行 定 向 修 饰 。此 类 PEG修 饰 剂 主 要 有 :
图 １ 三聚氯氰 － Ｐ Ｅ Ｇ 对蛋白质氨基的修饰
由于高锰酸钾过量时,处理后的水会 显 粉 红 色 。因 此 ,我 们 随 时 观 察 滤 前 水 的 变 化,要求值班人员每半个小时取滤前水水 样进行过滤,观察其颜色。
我们曾经考虑在水库出水口投加高锰 酸钾,这样,就可以把进厂水中的溶解性锰 含 量 控 制 在 0.1mg/L以下,但 由 于 我 们 的 输配水管在途中有农民灌溉用,所以,也只 能把投加点放在配水井。
中锰去除而保证水质(见表3)。
酸钾。
５ 投加高锰酸钾需要注意的问题
若高锰酸钾投加量超过需要量,处理 后的水会显粉红色,这是需要避免的,所以 必 须 严 格 控 制 。高 锰 酸 钾 投 加 量 允 许 在 一 定的安全幅度内变动,在安全幅度内,处理 水 的 性 状 可 保 持 良 好 。此 安 全 幅 度 的 大 小 随 水 中 PH值 而 变 ,PH值 越 高 ,幅 度 越 宽 ,且 所需投加量也相对减小。
蛋白质药物聚乙二醇修饰技术
蛋白质药物聚乙二醇修饰技术简介近年来，随着蛋白质药物的聚乙二醇修饰技术的发展，聚乙二醇化药物得到了广泛的应用。
目前已有十余种聚乙二醇修饰的蛋白药物上市，临床医疗效果优异，市场上也表现出了良好的业绩。
同时还有数十种聚乙二醇化蛋白质药物处在临床或临床前研究阶段。
聚乙二醇简介聚乙二醇（poly(ethylene glycol)）是一类聚醚类聚合物。
随着平均分子量的不同，性质也产生差异。
当分子量小于1000 Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠的液体，高分子量的聚乙二醇则是白色固体。
固体聚乙二醇的熔点正比于分子量，逐渐接近67℃的极限。
聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与水形成氢键，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，能改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快被消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。
聚乙二醇修饰的蛋白质一般构象不会改变，其结合物的生物学活性主要由结合物的蛋白质部分产生。
聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9×106 Da，本身的免疫原性也很低。
临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗时，未发现抗聚乙二醇抗体产生。
聚乙二醇是经美国食品药品管理局（FDA）批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。
聚乙二醇修饰又称分子的PEG化（pegylation），是20世纪70年代后期发展起来的修饰方法。
将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等。
聚乙二醇修饰反应类型在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。
活化的聚乙二醇通过与蛋白质分子上的氨基酸残基进行化学反应而实现与蛋白质的偶联。
这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>α-氨基>ε-氨基>羧基（羧酸盐）>羟基。
PEG型处方分析
PEG型处方分析1、PEG简介PEG是经环氧乙烷聚合而成的，相对分子量在200～8000或者8000以上的乙二醇高聚物，其由重复的氧乙烯基组成，不仅具有良好的水溶性，也能溶于DCM、DMF、苯、乙腈和乙醇等有机溶剂。
PEG 有2个末端羟基，具有线性的(相对分子质量为5000～30000)或支化的(相对分子质量为40000～60000)链状结构，线性PEG的分子式为H-(O-CH2-CH2)n-OH。
常用的PEG有PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG10000等，室温下相对分子量为200～600的PEG是液体，相对分子量为1000及以上者是固体。
2、PEG在制剂方面的使用PEG作为药用辅料至今，已有上百年的历史。
由于PEG毒性小，水溶性好，长期以来倍受广大药剂工作者的青睐，广泛的被应用于注射剂、局部用制剂、眼用制剂、口服及直肠用制剂等多种药物剂型。
PEG在水中具有较好的溶解性和良好的与药物及其他溶剂的相溶性，相对分子质量小的液体PEG可以在制剂中作为溶剂使用，相对分子力量大的固体PEG可以与难溶性药物制成固体分散体，以促进药物的溶出。
PEG200、PEG300、PEG400、PEG600系无色、略有微臭的粘性液体，化学性质稳定，安全低毒，故常作为药物的溶剂。
而PEG4000、PEG6000主要是片剂中水溶性润滑剂的典型代表，在片剂处方中可直接加入适量PEG进行整粒，也可将其先配成醇溶液、混悬液或乳液进行制粒，润滑效果不变。
利用PEG制得片剂的崩解和溶出不受影响，可提高主药在胃内的溶解性，最终有助于增加生物利用度。
除了可用作润滑剂，PEG还可作为粘合剂，其中以PEG4000最为常用，尤其是对于热不稳定药物，若采用PEG4000为粘合剂，可在干燥状态下进行粉末直接压片，效果较为理想。
除此之外，PEG还可作为增塑剂以改变聚合物的物理机械性质，使其更具柔顺性、可塑性；作为膜控型缓控释药物的致孔剂；作为渗透促进剂使角蛋白溶剂化，占据蛋白质的氢键结合部位，减少药物与组织间结合，增加并用的其他渗透促进剂在角质层的分配等。
聚乙二醇共价修饰药用蛋白质的分析方法实际应用研究
聚乙二醇共价修饰药用蛋白质的分析方法实际应用研究作者：田学军来源：《教育界·下旬》2014年第04期【摘要】目的：分析聚乙二醇共价修饰药用蛋白质的分析方法，了解其生物意义。
方法：本组主要对2011年7月至2013年7月期间聚乙二醇共价修饰药用蛋白质生物价值的研究资料作回顾分析。
结果：液相色谱方法、电泳方法、分光光度法等较为常用，能够清楚地了解到聚乙二醇对蛋白质表面自由氨基的修复作用。
结论：采用聚乙二醇共价修饰药用蛋白质，有利于降低使用药用蛋白治疗出现不良用药症状，提高临床疗效。
【关键词】聚乙二醇液相色谱方法电泳方法分光光度法聚乙二醇（polyethylene glycol ，PEG ）为高分子化合物，亲水性强、水动力体积大、无免疫原性，可通过对药用蛋白修饰作用促使药物水中溶解及生物分配特性变化、抑制酶解、促使空间屏障的产生，提升药物作用效果[1]。
为了解PEG修饰药用蛋白的特点，本文对2011年7月至2013年7月期间聚乙二醇共价修饰药用蛋白质生物价值的研究资料作回顾分析，现报道如下。
1资料与方法1.1临床资料整理分析2011年7月至2013年7月期间聚乙二醇共价修饰药用蛋白质生物价值的研究资料。
1.2方法结合近年来关于聚乙二醇共价修饰药用蛋白质生物价值的研究资料，对PEG共价修饰药用蛋白分析领域的液相色谱法、分光光度法及电泳法等特点及临床价值进行研究分析[2]。
1.3观察指标观察不同修饰分析方法下的蛋白修饰度、特定位点修饰程度、偶联不同PEG数量的蛋白相对含量。
1.4临床价值评定分析不同修饰分析方法难度及可操作性，以了解不同修饰分析方法的临床价值[3]。
1.5统计学分析本次数据采用SPSS16.0软件对本研究的数据进行统计学的分析，计数资料的对比应用卡方检验，而计量资料的对比应用t检验，P2结果液相色谱方法、电泳方法、分光光度法为PEG共价修饰药用蛋白常见分析手段：2.1 分光光度法应用此种分析方法源于20世纪70年代中期，由于三硝基苯磺酸和存在于蛋白表层的赖氨酸反应所产生的三硝基苯衍生物可被有选择地吸收，从而可以计算出蛋白质有多少数量的自由氨基，PEG共价修饰药用蛋白会使自由氨基在蛋白表面分布量减少，利用三硝基苯磺酸与蛋白质的反应可了解诶PEG修饰蛋白效果。
聚乙二醇结合蛋白的作用机制-概述说明以及解释
聚乙二醇结合蛋白的作用机制-概述说明以及解释1.引言1.1 概述：聚乙二醇（Polyethylene glycol，简称PEG）是一种具有线性结构的聚合物化合物，具有优良的水溶性和生物相容性，被广泛应用于药物输送、生物医学材料以及化妆品等领域。
同时，蛋白是人体内重要的生物大分子，承担着多种生理功能。
聚乙二醇与蛋白相结合，形成聚乙二醇结合蛋白复合物，具有调控蛋白稳定性、增加溶解度、改善药物传递等作用。
本文将探讨聚乙二醇结合蛋白的作用机制，为进一步深入了解聚乙二醇在生物医学领域中的应用提供理论支持和启示。
1.2 文章结构本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
- 引言部分将介绍聚乙二醇结合蛋白的概念及背景，引出本文的研究目的和意义。
- 正文部分将分为三个小节：聚乙二醇的特性、蛋白的结构与功能、以及聚乙二醇结合蛋白的作用机制。
分别从聚乙二醇和蛋白的基本特性入手，深入探讨它们的相互作用及在生物体内的作用机制。
- 结论部分将对本文进行总结，展望聚乙二醇结合蛋白在未来的应用前景，提出未来研究的方向。
通过以上结构的安排，有助于读者对聚乙二醇结合蛋白的作用机制有一个系统全面的了解。
1.3 目的目的部分的内容是为了明确本文的研究目的和意义。
本文旨在探讨聚乙二醇结合蛋白的作用机制，通过深入分析聚乙二醇与蛋白相互作用的方式和影响因素，揭示其在药物传递、生物医学领域等方面的应用潜力。
通过对聚乙二醇结合蛋白的作用机制进行系统总结和分析，有助于深化对该领域研究的理解，促进相关领域的发展与创新，为未来的研究提供参考和借鉴。
同时，本文旨在为探索新型的药物传递系统和生物材料的设计提供理论基础和实验依据，推动相关领域的发展和应用。
2.正文2.1 聚乙二醇的特性聚乙二醇（Polyethylene glycol，简称PEG）是一种具有线性结构的聚合物，由乙二醇的聚合物化合物组成。
其物理性质与化学性质使其在生物医药领域中得到广泛应用。
首先，聚乙二醇具有良好的水溶性。
蛋白质和多肽药物聚乙二醇化的问题与对策
药学 学 报 Ａ ｔ Ｐ ａ ｒｅｕ￣ ｉｉ ０ ， （ ） ３ ６ ４ ０ ｃ ｈｍ ｔ ｅ ｌ ａＳ ｃ ２ ２ ３ ５ ：９ ０ ａ ａ ｎａ０ ７
蛋 白质和 多肽 药 物聚 乙二醇化 的 问题 与对 策
姜 忠 义 ，高 蓉 ，王艳 强 ，孙 彦
能性减小 ；４ 被 肾脏 清除 的速率 降低 ；５ 药 物体 内 （） （） 分布和 动 力学 行 为改 变 ； ６ 贮 存 稳 定 性 提 高 。因 （） 此 ． 白质 和多 肽 药物 的聚 乙二 醇 化 一 直 是药 学 领 蛋 域 的研究 热点 ＝本 文就 聚乙二 醇化过程 中所 遇 到的
另 外 ， 于 聚 台 过 程 中 少 量 水 的 存 在 ， Ｐ Ｇ 产 由 ｍＥ 品 中 有 １ ～１ ％ 的 Ｐ Ｇ 二 醇 杂 质 二 醇 含 量 取 决 ％ ５ Ｅ 于 ｍＥ Ｐ Ｇ的 分 子 量 大 小 ， 子 量 越 小 ． 醇 的 含 量 越 分 二 低 。二 醇 在 ｍ Ｅ 的 活 化 过 程 中 会 形 成 不 期 望 的 交 ＰＧ
其亲核 活 性通 常按 下 列 顺 序依 次 递减 ： 基 ＞ｏ氨 巯 一 基 ＞￡ 基 ＞羧基 （ 一 氨 羧酸 盐 ） ）羟基 ：巯 基通 常存 在
于 蛋 白质 的 二 硫 键 和 活 性 位 点 上 ， 羧 基 如 果 不 与 而 蛋 白质上 的氨基 发生 分子 问 或 分 子 内 中和反 应 ， 也 很 难 活 化 因 此 ， 白 质 或 多 肽 分 子 最 容 易 与 修 饰 蛋 剂 发 生 作 用 的 位 点 是 分 子 表 面 赖 氨 酸 残 基 上 的 氨
（ 津 大 学 化 工 学 院 ， 津 ３０７ 天 天 ００ ２
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
关键 词 ： 白质 ； 肽 ；聚 己二 醇化 蛋 多 中 图 分 类号 ：Ｒ４ ：１ ７ ；Ｒ ７ ６ ９３ ｛ ７６ ９８ ｔ ９ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ５ ４ ７ 【０ ２０ —０９ ０ ０ １ ８０ ２０ ）５ ３６— ５ ３
聚乙二醇在药物制剂中的应用
聚乙二醇在药物制剂中的应用发表时间：2017-07-25T16:54:08.693Z 来源：《健康世界》2017年第9期作者：孙均[导读] 本文综述了聚乙二醇在纳米给药系统、微粒载体给药系统、靶向给药系统、、控释制剂、蛋白药物中的应用。
哈尔滨三联药业股份有限公司 150025摘要：本文综述了聚乙二醇在纳米给药系统、微粒载体给药系统、靶向给药系统、、控释制剂、蛋白药物中的应用。
关键词：聚乙二醇；药物制剂；应用引言分子量聚乙二醇（PEG）是一个相对比200年- 8000年或8000年的乙二醇聚合物的总称，是一个一步一步与水或乙二醇环氧乙烷加成聚合反应得到小分子量的一种水溶性聚醚、聚乙二醇（PEG）PEG200，PEG300，PEG400，PEG600，PEG1000，PEG4000，PEG6000，PEG10000等等。
在室温下，相对分子量的聚乙二醇200 ~ 600是液体，和相对分子量为1000以上是固体。
在中国药典和其他许多国家药典中，聚乙二醇被广泛用于医药产品的制备，被用作药物的补充。
正文一、聚乙二醇在液体制剂和注射剂中的应用1.聚乙二醇（PEG）是一种溶剂：聚乙二醇的相对分子量为1.1低，具有无色液体、化学稳定性、安全性、低毒性，可作为一种溶剂使用，有水、乙醇、甘油、丙二醇、混合苯甲醇作为复合溶剂。
聚乙二醇作为一种溶剂有三个功能：（1）增加不溶性药物的溶解度。
（2）提高容易分解水的药物的稳定性。
（3）当注射乙二醇作为溶剂时，药物可用于延长药物持续时间的时间。
现在已经有更多的药物可以由聚乙二醇作为溶剂或溶液的注射来制备。
液体聚乙二醇对人体的毒性较小，其毒性大于口服药物，尤其在高浓度和静脉注射液中。
2.聚乙二醇是一种溶解度聚乙二醇是一种高分子化合物，含有聚氧乙烯基、含羟基的分子结构，具有更大的水溶性，能提高水溶性难溶性药物的溶解度。
聚乙二醇（聚乙二醇）在溶解过程中，也可增加制剂的稳定性，提高物理性能，经常腐烂的味道掩蔽，减少刺激，提高吸收，增加药理作用。
聚乙二醇修饰蛋白质类药物的研究现状与进展
聚乙二醇醇修饰蛋白质类药物的研究现状与进展摘要：高分子前药可以控制药物释放速度，降低小分子药物的毒副作用，减少抗药性，增强抗肿瘤药物的靶向性和选择性，提高多肽、蛋白质和核酸类药物的稳定性和有效利用率。
由于聚乙二醇(PEG) 具有与蛋白质相容的特性, 用其对蛋白质类药物进行化学修饰已经成为医学和生物工程领域的热门课题, 得到了广泛的研究和应用。
PEG 修饰的蛋白质类药物已经逐渐成为新一代高效、低毒的治疗药物。
关键词：聚乙二醇蛋白质修饰高分子前药PEG 为一种亲水、不带电荷的线性大分子, 当它与蛋白质的非必需基团共价结合时, 可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇, 避免抗体的产生, 或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。
蛋白质经PEG 修饰后, 分子量增加, 肾小球的滤过减少; PEG 的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解, 同时减少了抗体的产生, 这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长。
当然, PEG 修饰也会影响到蛋白质的生物学活性, 这种影响的大小与修饰剂、修饰条件及蛋白质本身的性质等有关。
目前, 国内外对PEG 修饰蛋白质类药物的研究主要集中于天冬酰胺酶、腺苷脱氨酶、干扰素、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、超氧化物歧化酶、水蛭素、尿激酶、血红蛋白、单克隆抗体等, 其中腺苷脱氨酶、天冬酰胺酶、粒细胞集落刺激因子1.天冬酰胺酶（ASP）L-天冬酰胺酶（ASNase）能够催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸，将其与其他化疗药物相结合是治疗白血病的一种有效手段，但是由于它在血液存留时间短，长期接受治疗的白血病病人需要经常注射。
而ASNase是从大肠杆菌提纯出来的，在重复注射的条件下容易发生危险的免疫病【１】。
PEG修饰后的Ｌ－天冬酰胺酶可以降低免疫原性，聚乙二醇天冬酰胺酶于１９９４年２月上市，是第二个被批准的聚乙二醇药物，用于治疗急性淋巴性白血病和恶性黑色素瘤。
近年来，新的梳状ＰＥＧ衍生物分子ＰＭ１３和ＰＭ１００也被用于蛋白质的修饰。
【CN109682901A】聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910154241.4(22)申请日 2019.03.01(71)申请人 重庆派金生物科技有限公司地址 400700 重庆市北碚区丰和路106号(72)发明人 何云凤 丁琼 刘日勇 胡春兰 范开 (74)专利代理机构 重庆中之信知识产权代理事务所(普通合伙) 50213代理人 袁庆民(51)Int.Cl.G01N 30/02(2006.01)G01N 30/62(2006.01)G01N 30/74(2006.01)G01N 30/64(2006.01)(54)发明名称聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法(57)摘要本发明公开了一种聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，包括如下步骤：(1)使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线；(2)检测聚乙二醇化蛋白类药物的响应值；(3)根据标准曲线计算聚乙二醇化蛋白类药物中聚乙二醇、蛋白的含量；(4)计算聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度。
该方法可直接检测PEG修饰蛋白中的蛋白和PEG的量来确定PEG的修饰度，克服现有技术受外界干扰大的缺陷，具有准确性高、重现性好、通用性强、可标准化的特点。
权利要求书1页 说明书7页 附图3页CN 109682901 A 2019.04.26C N 109682901A权 利 要 求 书1/1页CN 109682901 A1.聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线；多种检测器可以组成检测单元，检测单元包括至少两种类型检测器；其中，一种类型检测器能同时检测聚乙二醇和未修饰蛋白且聚乙二醇与未修饰蛋白的响应值互不干扰，另一种类型检测器只能检测聚乙二醇或未修饰蛋白的响应值；(2)使用步骤(1)中的检测单元中的多种类型检测器检测聚乙二醇化蛋白类药物的响应值；(3)根据步骤(2)中检测器的类型以及步骤(1)中对应类型的检测器的标准曲线分别计算聚乙二醇化蛋白类药物中聚乙二醇、蛋白的含量；(4)根据公式计算聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度。
人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品总论
人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品总论1 概述聚乙二醇(polyethylene，PEG)是一类由环氧乙烷聚合而成的化合物，具有一定分子量分布与亲水性特点，呈线性、分支型及其他特殊类型的分子形态。
人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品是通过聚乙二醇端基的活性基团与重组蛋白或多肽的氨基酸侧链基团、N端/C端的氨基或羧基发生共价反应，修饰而成的治疗性药物。
本总论规定了人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品生产和质量控制的通用性技术要求，重点针对聚乙二醇修饰的重组蛋白产品。
涉及重组蛋白的生产及质量控制，还应符合“人用重组DNA蛋白制品总论” 及本版药典相关各论的具体要求。
2 制造2.1 基本要求人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品具有复杂的质量属性，应在充分了解临床应用目的的基础上确定制品的关键质量属性，以“质量源于设计”“风险评估”的原则和理念，确定相应的修饰策略、生产工艺、质量控制策略，并通过建立有效的“质量管理体系”保证制品的安全性和有效性。
人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品的制造主要包括重组蛋白和多肽的制备、聚乙二醇修饰、修饰产物的分离和纯化及制剂等过程。
生产过程中使用的原材料和辅料应符合本版药典的相关要求。
制备重组原型蛋白和多肽所需的工程细胞的来源、管理及检定应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”和“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求。
生产质量管理应符合中国现行《药品生产质量管理规范》的要求。
2.2 聚乙二醇应选用适宜的聚乙二醇进行修饰，并明确聚乙二醇的活性基团种类、拟成键的键型、分子形态、分子量范围等质量属性，以确保批间一致性。
2.2.1 分子量及多分散性可采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、凝胶渗透色谱-多角度激光散射(GPC-MALLS)检测器或凝胶渗透色谱-示差检测器(GPC-RID)等方法测定聚乙二醇的重均/数均分子量及多分散性。
2.2.2 端基取代率聚乙二醇的分子末端需经活性基团取代后方可与蛋白质和多肽上的反应基团发生修饰，可采用核磁共振(NMR)或液相色谱柱前衍生法进行测定。
PEG_蛋白质类药物的体内代谢与安全性评价
•专 论•PEG-蛋白质类药物的体内代谢与安全性评价张旋1，刘昌孝2 *1 天津派格生物技术有限公司，天津 300457；2 天津药物研究院释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津 300193摘 要聚乙二醇化蛋白质（pegylated protein，PEG-蛋白质）是延长蛋白质类药物半衰期的最有效的途径之一，通过延缓蛋白的排泄，提高其抗酶解的能力，增加其溶解性与稳定性，以及降低其免疫原性，可显著延长蛋白质类药物体内的生物活性，从而改善蛋白质类药物的药代动力学和药效学性质。
由于方法学上的限制，PEG-蛋白质类药物的代谢、组织分布和排泄研究极具挑战，但众多的文献资料表明，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）分子的体内代谢与安全性已经确立，无需过度担心PEG-蛋白质类药物的安全性。
将从PEG-蛋白质体内组织分布与排泄研究方法、PEG的代谢与安全性和PEG-蛋白质类药物动物和临床应用的安全性3方面介绍和评述PEG-蛋白药物的体内代谢与安全性评价问题。
关键词评价研究；代谢；聚乙二醇化；蛋白质类药物；安全性中图分类号：R969.1 文献标志码：A 文章编号：1674–6376（2010）04–0249–05In vivo metabolism and safety evaluation of PEGylated proteins drugsZHANG Xuan1, LIU Changxiao21 Tianjin Pegylatt Biotechnology Co. Ltd., Tianjin 300457, China2 State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin300193, ChinaAbstract Pegylation is one of the most effective methods to prolong the serum half-life of therapeutic protein drugs, by delaying clearance, increasing solubility as well as stability, protecting against susceptibility to enzymatic degradation, and reducing immunogenicity. The PEGylated proteins have also enhanced their pharmacokinetic and pharmacodynamic performance along with sustained actions. However, it is a significant challenge for studying the metabolism, distribution and excretion of PEGylated proteins because of the limitation of methods. Fortunately, literature data indicate that the polyethylene glycol (PEG) associated with a protein should provide no extra concern because the exposure-toxicity relationship of PEG between animals and humans has been thoroughly investigated and metabolism / excretion of PEG is well understood. We reviewed the metabolism and safety evaluation of PEGylated proteins, through introduction and assessment of the method limited for studying distribution and excretion, the in vivo metabolism and safety of PEG, and the toxicity of PEGylated proteins in animals and humans.Key words Evaluation study; metabolism; pegylation; PEGylated protein; safety化学修饰是延长蛋白质类药物半衰期的有效途径之一，是一种将相对分子质量小的蛋白质类药物共价连接到较大相对分子质量的分子上，例如PEG 和白蛋白。
聚乙二醇化蛋白质类药物的结构分析方法
聚乙二醇化蛋白质类药物的结构分析方法摘要近年来,聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一,得到越来越广泛的应用。
鉴于聚乙二醇本身的特性与蛋白质结构的复杂性，如何使它更好的修饰蛋白并对修饰后产物进行分析鉴定是研究的重点与难点。
本文主要就PEG定点修饰的技术和PEG化蛋白的成分、结构分析方法及各种方法的优缺点作一介绍，并展望了未来的发展趋势。
Abstract Polyethylene Glycol(PEG) modification technology has become one of the most effective technologies in protein drugs ,getting more and more widely used in recent years. In view of the characteristics of polyethylene glycol itself and the multiple structure of proteins,it’s necessary and difficult to achieve better modification and analyse the Modified products. In this paper,we fixed on the PEG-modified-protein technology and components, structural analysis methods and the advantages and disadvantages of various methods to make a presentation and prospect the future trend of development.关键词：蛋白类药物，聚乙二醇化，修饰位点，结构分析方法Key words:Protein drugs, Peginterferon, modification sites, structure analysis methods.正文药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上。
PEG蛋白质类药物的体内代谢与安全性评价
PEG蛋白质类药物的体内代谢与安全性评价作者：章佳佳来源：《中国卫生产业》 2014年第1期[摘要] PEG-蛋白质可以有效地延长蛋白质药物半衰期，可以减缓蛋白的排泄速度，并提高蛋白质的抗酶解能力，以此来增加PEG-蛋白质的稳定性和溶解性，降低免疫原性，延长蛋白质类药物在体内的生物活性，对其药物动力学和药效学性质进行改善。
但是在实际应用过程中，由于方法学的限制，PEG-蛋白质类药物在进行代谢、组织分布和安全排泄等研究时，无法得到正确的体内代谢与安全性评价。
本文通过对PEG-蛋白质体内组织分布与排泄方法的研究，对PEG 的代谢与安全性的研究以及对PEG-蛋白质类药物动物和临床应用的安全性的研究，得到了正确的PEG-蛋白药物的体内代谢与安全性评价。
[关键词] PEG-蛋白质；体内代谢；安全性评价[中图分类号] R969.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）01（a）-0191-02随着社会技术的不断发展，医疗技术的研究也取得了非常多的成果，基因工程技术就是其中最重要的一种[1]。
而蛋白质类药物作为基因工程技术的主要构成部分，已经越来越受到人们的重视，研究工作也逐渐开展起来。
但是由于蛋白质类药物的血浆半衰期比较短，免疫原性不足，严重阻碍其在临床医学上的推广[2]。
为了扩大蛋白质类药物的使用范围，研究人员采用化学修饰方法，化学修饰主要是将相对分子质量小的蛋白质类药物共价连接到相对分子质量比较大的药物上，如聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）。
通过修饰后，PEG-蛋白质类药物成为了新一代的高效、低毒药物[3]。
为了加强对PEG-蛋白质类药物的体内代谢与安全性评价的认识，本文从PEG-蛋白质体内组织分布与排泄、代谢与安全性、动物和临床应用的安全性着手。
1 PEG-蛋白质体内组织分布与排泄研究方法主要采用同位素标记方法对新药的体内组织分布和排泄进行研究。
常用的同位素如131I、3H等，将这些同位素标记为PEG分子。
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聚乙二醇化蛋白质类药物的结构分析方法摘要近年来,聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一,得到越来越广泛的应用。
鉴于聚乙二醇本身的特性与蛋白质结构的复杂性，如何使它更好的修饰蛋白并对修饰后产物进行分析鉴定是研究的重点与难点。
本文主要就PEG定点修饰的技术和PEG化蛋白的成分、结构分析方法及各种方法的优缺点作一介绍，并展望了未来的发展趋势。
Abstract Polyethylene Glycol(PEG) modification technology has become one of the most effective technologies in protein drugs ,getting more and more widely used in recent years. In view of the characteristics of polyethylene glycol itself and the multiple structure of proteins,it’s necessary and difficult to achieve better modification and analyse the Modified products. In this paper,we fixed on the PEG-modified-protein technology and components, structural analysis methods and the advantages and disadvantages of various methods to make a presentation and prospect the future trend of development.关键词：蛋白类药物，聚乙二醇化，修饰位点，结构分析方法Key words:Protein drugs, Peginterferon, modification sites, structure analysis methods.正文药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上。
药物的聚乙二醇修饰可分为两个阶段。
第一阶段的修饰技术局限于应用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇(<20000)。
常用的修饰剂有单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)、单甲氧基聚乙二醇碳酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SC)等,通过酯键或三嗪环将聚乙二醇与药物分子偶联,这种非特异性的不稳定连接方式使得一个药物分子经常连接数个聚乙二醇分子【 1 】。
但第一代聚乙二醇修饰药物通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性,生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。
以应用相对分子质量高(>20000)聚乙二醇修饰剂为特征的第二阶段的修饰技术具有连接稳定、定点修饰、控释等特点,修饰后的药物具有更高的生物活性、更好的物理及热稳定性、更高的产品均一性和纯度。
但总得说来,蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一,给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。
根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点,科研人员开发了多种定点修饰的策略和方法。
1 修饰氨基多肽蛋白质分子参与PEG化反应的基团常为α-和ε-氨基,因此用于修饰氨基的单甲氧基聚乙二醇衍生物(mPEGs)种类较多,可分为烷基化mPEGs和酰基化mPEGs两大类。
烷基化mPEGs,包括mPEG-醛、mPEG-三氟乙磺酸及mPEG-环氧化物等。
其中mPEG-醛的修饰条件温和,交联时不引入其他活性基团,在低pH下仅修饰N-末端氨基,对活性影响较小,同时方便产物的纯化和鉴定,已用于G-CSF、IFN 及CD4-IgG等的修饰【 2 】。
mPEG-三氟乙磺酸的修饰条件也较温和,对GM-CSF修饰后使其保持较好活性。
mPEG-环氧化物虽制备简单,但偶联物含活性羟基,易发生其他交联反应,修饰率也较低。
酰基化mPEGs,包括mPEG-琥珀酰亚胺酯和mPEG-苯并三唑碳酸酯,这两种修饰剂可优先与赖氨酸残基反应,也可与组氨酸和酪氨酸残基反应。
此外,mPEG-硝基苯碳酸酯、mPEG-三氯苯碳酸酯及mPEG-氧羰基咪唑比前述两种反应活性低,但修饰专一性较好。
2基于氨基保护的定点修饰对于蛋白中含有多个修饰位点,可以利用氨基保护试剂对修饰后会导致蛋白失活严重的位点实施保护,对活性高的修饰位点进行定点修饰后,再将保护试剂去除。
Youn等【 3 】研究发现生长激素释放因子(GRF)由于蛋白水解和肾小球过滤作用,其在体内的半衰期非常短,无法有效发挥药效,因此选择PEG修饰技术解决这些问题。
但是在该蛋白序列上,有3个修饰位点(Try1,Lys12和Lys21),其中修饰第21位赖氨酸的氨基可以使蛋白保持最高的生物活性,因此,将1位Try和12位Lys的氨基进行92芴甲氧羰基(FMOC)修饰保护后,用活化mPEG修饰21位Lys 获得定点修饰蛋白,然后再将FMOC去除。
这样既能保持生物活性,又能获得半衰期长,稳定的蛋白药物。
3修饰羧基有一些蛋白的N端对其生物活性起着重要作用,如果在N端实施PEG修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将PEG修饰的位点转移至C端则是一种有效的修饰策略。
一般选用mPEG-酰肼或mPEG-胺对蛋白质进行修饰,羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。
mPEG-酰肼是近年来开发的又一种可与羧基特异性结合的修饰剂。
4修饰巯基与赖氨酸相比,半胱氨酸在蛋白质中出现几率和数量很少,利用具有巯基反应活性PEG衍生物就可以实现蛋白定点修饰,但缺点是半胱氨酸的巯基通常处于蛋白的活性中心,修饰后会使蛋白活性损失较大。
对于没有半胱氨酸的蛋白则可以通过基因工程手段引入巯基反应位点。
这一方法不但能够实现高度选择性修饰,而且能够减少蛋白生物活性的丧失,并降低免疫原性【 4 】。
目前可用于巯基修饰的mPEGs包括mPEG-马来酰亚胺、mPEG-邻吡啶-二硫醚、mPEG-乙烯基砜及mPEG-碘乙酰胺等。
其中mPEG-马来酰亚胺制备简单,应用较多。
PEG-邻吡啶-二硫醚与蛋白质偶联形成的S—S键,在生理条件下可缓慢水解,释放出天然蛋白质,有利于活性的恢复,但修饰率低。
PEG-乙烯基砜在pH7-9范围内可选择性的与巯基反应,当pH较高时则与氨基交联。
PEG-碘乙酰胺的优势在于经强酸水解后,可释放出半胱氨酸衍生物,易于鉴定。
5二硫键定点修饰对蛋白中含有的二硫键进行PEG定点修饰分为2个步骤:首先利用温和的还原剂使二硫键还原释放两个硫氢基;第二步通过PEG修饰剂的双烷基化反应重建二硫键,从而完成PEG的定点修饰。
在修饰蛋白过程中不会出现蛋白的不可逆变性,而且二硫键还原后蛋白仍维持其三级结构,PEG选择性的修饰两个硫基,PEG 的立体屏障作用确保1个二硫键只结合1分子PEG。
但是二硫键PEG修饰可能会由于PEG的屏蔽作用,降低蛋白的生物活性。
Veronese等【 5 】利用变性剂盐酸胍(3mol/L)使蛋白部分变性,高级结构打开,但不使用还原剂以保护二硫键,在非折叠状态下完成PEG修饰后,通过透析或凝胶过滤色谱的方法去除变性剂,使蛋白重新正确折叠恢复生物活性。
6非极性氨基酸定点修饰通常只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行PEG化学修饰。
Deiters等开发了一种定点修饰非极性氨基酸苯丙氨酸的方法,首先用叠氮化物通过亲核取代反应修饰蛋白质中的苯丙氨酸生成对位叠氮化苯丙氨酸,再用炔烃衍生的PEG-酰胺修饰剂修饰苯丙氨酸,发生环化加成反应形成稳定的连接体,从而完成对蛋白的定点修饰。
另外,通过基因重组在蛋白质中引入含叠氮基团的氨基酸残基,再与特定PEG修饰剂偶联形成稳定的定点单修饰产物。
Cazalis【 7 】通过基因工程方法在血栓调节蛋白(Thrombomodulin)的C端引入叠氮蛋氨酸,与mPEG2三芳基膦(mPEG2triarylphosphine)修饰剂生成稳定的单修饰物,尽管该方法比较复杂,但至少给我们提供了一个新的PEG修饰蛋白的思路。
7糖蛋白中糖基定点修饰此类PEG定点修饰的原理是:首先用葡萄糖氧化酶或高磺酸钠氧化糖类残基产生具有反应活性的醛基,这些醛基可与mPEG2肼衍生物反应生成腙或与mPEG2胺衍生物反应生成可逆的Schiff碱。
用硼氢甲腈钠可将腙还原为更稳定的烷基肼化物,而Schiff碱可以还原为仲胺。
相对于mPEG-胺衍生物修饰,PEG-肼衍生物修饰不会形成交联聚合体,更适合于糖基的修饰,最有代表性的mPEG2肼衍生物是mPEG2酰肼(hydrazide2mPEG)。
酰肼基团极低的pKa值使得酰肼基团在酸性环境下(pH4.5～5.0)中仍可以和羧基结合,而蛋白质中的氨基在该条件下由于发生质子化而不能与羧基反应,从而可实现选择性定位修饰。
由于蛋白种类多样和结构复杂,往往会使得PEG修饰反应特异性不强,反应条件要通过大量试验优化。
如果能够利用计算机技术对蛋白质晶体结构表面性质进行理论计算和分析,确定可能的反应位点和基团,并根据被修饰基团与修饰剂的结构特点设计合适的连接物,这样不但可以减少PEG修饰的盲目性,而且能够提高研究效率。
胡远东等【8 】利用InsightⅡ分子模拟软件包(BiosymInc.,SanDiego,CA)对牛血红蛋白晶体(bHb)进行了结构分析和分子模拟,计算了蛋白表面24个可进行PEG修饰的Lys残基及其主要原子的溶剂可及表面积,确定了其中可以进行修饰的13个Lys残基(溶剂可及表面积>0.4nm2),并进一步设计了具有双功能基团的小分子化合物环氧乙烷基活化PEG作为连接体。
结果表明,PEG修饰的bHb的携氧能力和免疫原性等生物学指标均达到预期结果。
聚乙二醇修饰的鉴定与检测PEG分子存在一定的相对分子质量分布,因此,PEG修饰的多肽蛋白质无精确理论相对分子质量。
此外,蛋白质表面可修饰的氨基位点较多难于实现定点修饰,从而使PEG修饰的空间结构进一步复杂化。
总之,蛋白质与聚乙二醇反应后的产物是混合物,即使是相同修饰度的蛋白质分子之间也会因修饰位点的不同而呈现多态性。
这种多态性给聚乙二醇修饰的多肽蛋白质的分析带来较大困难。
PEG化蛋白质的检测与分析至少应该有三个方面(1)蛋白的平均修饰度(2)PEG修饰的位点及特定位点被修饰程度(3)不同修饰度的蛋白质的相对含量其中PEG修饰的特定位点及特定位点被修饰程度的检测目前研究的还比较少，不成熟。
现将几种常用的检测分析方法介绍如下:1分光光度法和荧光胺法来检测聚乙二醇修饰程度自从1960年Satake等介绍用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定蛋白质氨基浓度以来，该方法已成为测蛋白质修饰度最常用的方法。