细菌药敏试验及其耐药表型检测.
第章细菌药敏试验及其耐药表型检测
第章细菌药敏试验及其耐药表型检测细菌药敏试验是临床细菌感染治疗中非常重要的检测手段，通过该技术可以检测不同抗生素对细菌的敏感性，进而为合理使用抗生素提供科学的依据。
然而，在临床应用过程中，随着抗生素不合理使用的增加，细菌耐药性也随之快速发展。
因此，针对不同耐药表型的检测越来越受到关注。
一、细菌药敏试验细菌药敏试验是一种用于判断细菌对不同抗生素敏感性的方法。
常见的细菌药敏试验方法包括纸片扩散法、E测试、革兰氏染色法、微量稀释法等。
其中纸片扩散法是最常用的一种方法，其原理是将待检细菌涂在琼脂平板上，然后在板上放置一些含有不同抗菌药物的试纸，细菌耐药性差的部分会被试纸上的抗生素杀灭，出现纯净孔（抑菌圈），通过抑菌圈的直径可以初步判断细菌对抗生素的敏感性或耐药性。
细菌药敏试验有很多应用价值，如能够帮助医生选择合适的抗生素治疗细菌感染，避免了不必要的抗生素使用，同时也可作为科研人员研究细菌抗药机制的工具，为抗菌药物的开发提供依据。
二、耐药表型检测随着细菌抗药性问题的不断加重，对不同耐药表型检测的需求也越来越迫切。
耐药表型是指细菌对特定抗生素的耐药情况。
由于不同的细菌及其不同的菌株对抗生素的敏感程度有所不同，因此抗菌药物在应用过程中会出现不同菌株对不同药物的耐药表型。
目前，针对不同耐药表型检测的方法主要有两种：基于分子生物学技术的方法和基于药敏试验的方法。
1. 基于分子生物学技术的方法基于分子生物学技术的方法是检测细菌耐药性最常用的方法之一。
该方法通过检测细菌中特定的基因或者基因片段，以此确定细菌耐药性的表型。
常见的基于分子生物学技术的方法包括PCR检测、基因芯片技术、实时荧光定量PCR等。
2. 基于药敏试验的方法基于药敏试验的方法是已经成熟的检测方法之一，其通过将药敏试验的结果与临床药物疗效相结合，进而确定细菌耐药性表型。
通过检测不同抗生素对不同菌株的敏感性，可以初步反映出细菌的耐药性状态。
当然，这种方法不仅涉及到耗时、耗材、人力等成本的问题，而且还受到试验条件、条件操作等方面的影响。
细菌药物敏感试验实验报告
细菌药物敏感试验实验报告药物敏感性试验的基本原则1药敏试验检测获得性耐药，不必测试天然耐药：天然耐药是细菌菌种固有的特征，耐药基因一般位于染色体，可以长期稳定遗传，表现为对某类或某种药物的天然耐药。
天然耐药信息一般由基础医学和临床文献提供。
部分天然耐药，体外试验条件下可能无法检测出来，因而导致假敏感，如果报告将成为极重要错误，严重误导临床。
常见菌种对各类药物的天然耐药见文献。
实验室全体人员应熟知这些信息，可将其发给临床学习和参考。
2药敏试验测试的前提条件：实验室应具备相应检测的人员能力、客观条件、结果解释依据。
标本处理、菌株分离鉴定、药敏试验操作等环节规范、标准、结果可信；具备对结果的解释能力，能够提供临床会诊服务。
临床常规工作，分离株(可能)有临床意义而非定植或污染时，才可进行药敏试验。
错误示例：来自痰标本的溶血葡萄球菌，未作标本质量评估和半定量培养，进行药敏试验；来自粪便标本肠球菌属进行药敏试验等。
3测试结果应准确：实验室应遵照CLSI文件或相关规范建立本医院药敏试验的质量管理体系。
质控菌株、频率、质控范围符合相关要求；定期参加实验室室间比对项目。
建议保留菌株，以便复核。
具体的专业要求1标本类型临床微生物学的一大特点是标本种类繁多，而不同药物在这些部位的分布不同。
标本的规范采集、质量保证、立即运送和有效保藏有赖于临床、实验室以及相关各方的密切合作。
在规范临床送检的前提下，实验室进行药敏试验和报告药敏结果时，应首先考虑标本的特殊性。
实际工作中需重点考虑的标本如下。
1．脑脊髓液：正常和疾病状态不能穿透血脑屏障的药物，常规不应报告。
报告审核时，对于分离自脑脊髓液的菌，下列药物不能报告：仅有口服剂型的抗菌药物、一、二代头孢菌素(除外静脉用头孢呋辛)、头霉素类、克林霉素、大环内酯类、四环素类和喹诺酮类。
2．尿液：有些药物如呋喃妥因，仅限于测试和报告尿分离株，其他标本的分离株，不应报告此药；尿道标本常规不应报告氯霉素。
药敏试验方法及细菌耐药性(药剂科2016.4.20)
4.E-TEST
以纸片扩散法的操作方法获得MIC值的一种药敏试验。 操作上有纸片扩散法的优点，结果准确性可与稀释法媲美。 缺点：昂贵
结果
五、药敏结果的判读
MIC值或抑菌环直径 药物的临界浓度（CLSI、EUCAST、FDA) 比较
临界浓度:又叫折点（breakpoint）。即根据抗菌药物 抑制细菌生长所需要的MIC结合常用剂量时在人体内 所能达到的血药浓度划分细菌对各种抗菌药物敏感 和耐药的界限。
贴纸片：手工，纸片分配器 孵育：(35±2）℃，空气或CO2
纸片扩散法
结果
纸片扩散法的特点
简便，便宜，不同层 次实验室均可正规操 作，是目前推荐的临 床试验室使用方法。 检测的是抑菌环直径 （mm)
2.肉汤稀释法
药液的准备：
256μg/ml 128 64 32 …… 0.25 0.125 0.06 13个梯度
氨
苄
阿
莫
抗菌药物
盛京医院2015年统计数据
2015 年 分 离 金 黄 色 葡 萄 球 菌 对 抗 菌 药 物 的 耐 药 率
100 80 耐 药 率 ％ 60 40 20 0
19.5 15.9 5.2 19 18.6 15.9 25 0 0 0 0.3 24 0 90.9 75
G
林
素
星
星
因
胺
素
平
29.3 21.9 26.6 20.6 8.3 35.3 35.5 36 11.7 98.3 97.9 98.4 93.4 97.4
15.8
14.5
苄 氨 氨
哌 苄
西
拉
哌
抗菌药物
盛京医院2015年统计数据
第4章细菌药敏试验及其耐药表型检测-文档资料
-测试抑菌圈周围的细菌；
-如果β-内酰胺酶阳性,报告青霉素R。
Pos
Neg
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）
ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌 素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；
ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被 克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂 所抑制；
ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外 也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙 雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单 胞菌。
体积 (mL)
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CAMHB 最终浓度 (mL) （mg/mL）
9
512
1
256
3
128
7
64
1
32
3
16
7
8
1
4
3
2
7
1
1
0.5
3
0.25
7
0.125
抗菌药物的稀释和融解
肉汤稀释法
4
8
混
16 32 64 128 256 ug/ml 混清
抗生素倍比稀释，种菌105CFU/ml ， 孵育35℃， 16～20h，判读。
E test 法
优点
连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 影响因素少，稳定性高 操作简单，省时
缺点：昂贵 用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，
分枝杆菌
2024/7/17
35
评价药物体外抗菌活性的指标
MIC50, MIC90, MIC 均值， MIC 范围，R，I，S MIC50/ MIC90：MIC从小到大排列，位于第50 / 90
细菌耐药表型检测方法剖析
金属β-内酰胺酶的表型检测方法
2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H 平板上。 （2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚 胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h。 （3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性， 即产金属β-内酰胺酶。
五、肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证 （2009年CLSI:M100-S19.APPB.124）
1.如果菌株对碳青霉烯类药物表现为“I”或“R”没必 要再去检验该酶，（医生通常不会选用“I”或“R” 的药物），但主要以感染控制为目的检验该酶。 2.什么是碳青霉烯酶？ 一类能水解或灭活碳青霉烯类抗生素的酶，如： KPC（肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶）. • 碳青霉烯类抗生素 －Doripenem（目前无CLSI折点） －厄他培南 －亚胺培南 －美洛培南
（3）双纸片协同确认试验： 头孢他啶（ 30μg/ 片）与头孢他啶（ 30μg ） / 克位维 酸（10μg） 头孢噻肟（ 30μg/ 片）与头孢噻肟（ 30μg ） / 克拉维 酸（10μg）两纸片抑菌圈相比≥5mm即为ESBLS。 （ 4） E-test法（浓度梯度法）：由瑞典 AB Biodisk 公司研究生产，广洲贝肯公司经销。试条中的三代 头孢菌素或氨曲南的 MIC≥2μg/ml 即可疑为 ESBLS 。
附：鉴定卡他球菌方法
1.40%KNO3浸湿滤纸条，贴于羊(马)血平板上，周 围点种待测菌，如果菌落周围出现大的绿色环 ， 即为阳性。 2.丁酸酯酶检测法：购买丁酸酯酶检测纸片(梅里埃 公司生产)，涂细菌于纸片上，如几分钟内出现绿 色为阳性。
实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
细菌药敏试验及其耐药表型检测
细菌
抗菌药物
嗜麦芽窄食单胞 甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、左氧氟沙星、米诺环素、氯霉素、头孢他啶、替卡西林/克拉维
菌
酸）
肠球菌属
氨苄西林、替考拉宁、环丙沙星或左氧氟沙星、万古霉素、红霉素、高浓度庆大霉素 （CN120）或高浓度链霉素（STH300）、青霉素、利奈唑胺、呋喃妥因（尿标本）
肺炎链球菌
苯唑西林、红霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素b(MIC)、头孢噻肟或头孢曲松b (MIC)、万古霉素、美罗培南（脑脊液标本）
• 抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与 该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。 即抑菌圈愈大，MIC愈小。
纸片扩散法
试验方法 1 于纯培养平板上，挑取相同的菌落4~5个 2 用无菌生理盐水制成0.5麦氏单位（真菌为2.0麦氏单位）的
细菌悬液
纸片扩散法
3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；
MIC与抑菌圈直径的线性关系
Log2. MIC
R v
I
S
耐药
中介 敏感
抑菌圈直径（mm)
现有主要标准
• 临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）
• 欧洲抗菌药物敏感性试验委员会 EUCAST • 参考标准 ISO 20776-1 （国际微量肉汤稀释法的参考方
氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、头孢唑啉、头孢西丁、庆大霉素、妥布霉素、青霉素、利 福平、磷霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、环丙沙星或左氧氟沙星、克林霉素、红霉素、苯 唑西林、替考拉宁、万古霉素(MIC)、利奈唑胺、呋喃妥因（尿标本）
头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、氨曲南、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉 西林/他唑巴坦、左氧氟沙星或环丙沙星、阿米卡星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素、 庆大霉素、哌拉西林、多粘菌素
细菌药敏试验及其耐药表型检测课件
药敏试验的分类
纸片扩散法
将抗菌药物纸片贴在接种了待测 菌的琼脂平板上，通过测量抑菌 圈大小来确定细菌对药物的敏感
程度。
稀释法
通过不同浓度的抗菌药物与细菌在 琼脂平板上接触，观察细菌生长情 况，以判断药物的抑菌浓度。
E-test法
将抗菌药物浓度梯度试纸贴在接种 了待测菌的琼脂平板上，根据抑菌 圈边缘与试纸条的交汇点读出最低 抑菌浓度值。
点，是临床常用的药敏试验方法之一。
04
药敏试验的结果解读
结果判读标准
敏感（Susceptible）
01
表示细菌对药物敏感，通常为≤2μg/ml或≤10μg/ml，具体标
准根据药物种类和实验方法而异。
中介（Intermediate）
02
表示细菌对药物中度敏感，通常为2μg/ml＜MIC＜10μg/ml或
某些细菌可以产生酶类，将药物分解 或灭活，从而降低或消除药物的抗菌 作用。
抗菌药物作用靶点的修饰
细菌通过增加或改变靶点蛋白的数量 或修饰状态，降低药物与靶点的结合 能力。
03
药敏试验的方法
纸片扩散法
总结词
一种常用的药敏试验方法
详细描述
纸片扩散法是一种简便、快捷的药敏试验方法，通过将含有一定浓度的抗菌药 物的纸片贴在接种了待测菌的琼脂平板上，观察细菌周围的抑菌圈大小，判断 细菌对药物的敏感程度。
细菌药敏试验及其耐药表型检测课 件
目录
• 细菌药敏试验概述 • 细菌耐药性及耐药表型 • 药敏试验的方法 • 药敏试验的结果解读 • 耐药表型检测的应用 • 展望与未来发展方向
01
细菌药敏试验概述
药敏试验的定义
• 药敏试验：指通过实验室方法检测细菌对抗生素等抗菌药物的敏感程度，为临床医生提供抗菌药物选择依据的过程。
抗菌药物敏感性试验与细菌耐药性检测
2.试验方法及结果判读
三、实验内容
1、实验材料
（1）药敏纸片： ① 用于G+c：红霉素、克林霉素、万古霉素、替考
拉宁、复方新诺明、新生霉素、头孢 西丁 ② 用于G-b：环丙沙星、亚胺培南、头孢曲松、 头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、 阿莫西林/棒酸
（2）菌株： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌标准菌株；
3、掌握葡萄球菌克林霉素诱导耐药（D试验） 的检测方法及结果判读。
二、实验原理
（一）抗菌药物敏感性试验检测
（二）细菌耐药表型检测
（一）抗菌药物敏感性试验
四种方法
1、纸片琼脂扩散法（K-B法） 2、稀释法 （1）肉汤稀释法 （2）琼脂稀释法 3、E-test法 4、联合药敏试验
纸片琼脂扩散法
1.基本原理
2、试验方法
MRS菌株的表型检测方法主要有头孢西丁 纸片扩散法、苯唑西林稀释法和苯唑西林盐 平板筛选试验，以头孢西丁纸片扩散法最常 用。
头孢西丁纸片扩散法解释标准
葡萄球菌克林霉素诱导耐药的检测 （D-test）
1.基本原理：
对大环内酯类耐药的葡萄球菌可能有天 然或诱导性对克林霉素的耐药，或只对大环 内酯类耐药。本试验可以测定诱导性的克林 霉素耐药。
2、什么叫D-test？该项检测有何意义？
2.试验方法
7
3.结果判读
用游标卡尺量取抑菌环直径，根据CLSI标准， 报告细菌对该抗菌药物是敏感（S）、中介 （I）还是耐药（R）。
4.注意事项
（1）菌液浊度应配制成0.5麦氏单位； （2）菌液调配好后应在15min内接种完； （3）菌液涂布药敏琼脂后应放置3-5min再贴
药敏纸片； （4）贴完纸片后不能再移动纸片；
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验
药敏实验常见问题、常见耐药机制及耐药表型解读
药敏实验常见问题、常见耐药机制及耐药表型解读药物敏感性试验可以监测细菌对抗药物的敏感性，为临床合理用药、新药研究、监测耐药变迁、发现耐药机制等提供客观依据。
常见问题为什么临床微生物学实验室有时候出具的报告只有细菌名，而没有出具药敏结果？目前国内药敏报告主要参照CLSI M100标准出具药敏报告。
该标准只给出了临床常见细菌诸如肠杆菌科细菌、非发酵菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、某些厌氧菌的判读标准。
若鉴定细菌不在该文件范围内，则无法给出药敏结果。
如单核细胞增生李斯特菌、诺卡菌、布鲁菌等特殊细菌，需要特殊的培养基或培养条件，而许多实验室不具备这些条件，因此只能出具细菌名。
尽管只有细菌名称，但对临床抗感染治疗依然具有指导意义。
在条件允许的情况下，检验人员可以尽可能多地向临床提供该菌相关的知识，如该菌的染色性质（革兰阳性还是阴性）、球菌还是杆菌、药敏情况等。
如何解释部分抗菌药物体外敏感试验的药物种类与临床实际使用抗菌药物种类不一致？抗菌药物体外敏感试验中，由某一药物的药敏结果可以“预测”或“指示”其他药物敏感或耐药的药物。
若存在这种预测药或指示药，则无须加做药敏试验。
临床需要掌握相关专业知识，实验室需向临床解释结果。
表1 药敏试验常用试验药物及代表药物如何解释抗菌药物在体外敏感试验显示敏感，临床治疗却无效？常见原因如下：①分离株如果是定植菌、污染菌，则无须抗菌药物治疗。
治疗无效是正常情况。
②患者免疫力、基础性疾病不改善，临床治疗常无效。
③如果有感染灶未发现或未予清除，单纯的抗菌药物治疗可能无效。
④实验室结果应准确无误。
如果耐药错误判断为敏感，则治疗无效。
⑤“90~60规则”提示，有10%的患者敏感时治疗无效。
如果临床统计结果与该规则比较一致，则应该视为正常情况。
⑥药敏试验适用于浮游菌感染。
如果是生物膜感染，则药敏试验不适用。
⑦药物使用要符合说明书剂量，与CLSI M100等文件剂量一致或更高。
低于CLSI M100等文件的剂量建议，则敏感可能无效。
药敏试验耐药实验报告
药敏试验耐药实验报告1. 引言药敏试验耐药实验是一种重要的药物敏感性检测方法，用于评估细菌对药物的耐药性。
在这个实验中，我们通过药物与细菌的相互作用，确定细菌对不同药物的感受性，从而为临床合理使用抗生素提供参考。
2. 实验设计2.1 实验材料- 不同种类的细菌培养物- 不同种类的抗生素药物- 维生素和蛋白胨培养基- 培养皿和排线器- 实验室培养箱、离心机、显微镜等实验设备2.2 实验步骤1. 选择待测细菌进行预培养；2. 制备不同稀释浓度的抗生素药物溶液；3. 制备含有维生素和蛋白胨的培养基；4. 在培养皿中接种不同稀释浓度的抗生素溶液和细菌培养物，分别标记；5. 培养皿置于培养箱中以适宜的温度孵育；6. 观察培养皿中细菌生长情况，并记录结果；7. 使用排线器在耐药圈周围绘制抗生素浓度的梯度图；8. 根据抗生素浓度的梯度图分析耐药性的形成。
3. 实验结果通过药敏试验，我们观察到不同细菌对抗生素药物的感受性存在差异。
在培养皿中，对于某些细菌，抗生素溶液抑制了其生长，形成明显的抑菌区，而对于其他细菌，抗生素溶液的影响较小，细菌能够生长并形成耐药圈。
据分析，耐药圈的大小与抗生素的浓度成正比。
当抗生素浓度较高时，耐药圈较小；而当抗生素浓度较低时，耐药圈较大。
这一结果表明，细菌通过适应环境选择抗生素的浓度和类型达到耐药性。
4. 结论1. 细菌对抗生素的耐药性与抗生素的浓度和类型有关；2. 对某些细菌而言，抗生素溶液能够抑制其生长并形成明显的抑菌区；3. 耐药圈的大小与抗生素浓度成正比；4. 药物敏感性检测可为临床合理使用抗生素提供参考。
5. 讨论与展望本实验利用药物敏感性检测方法评估了细菌对抗生素的耐药性，结果表明细菌的耐药性与抗生素的浓度和类型有关，这为合理选用抗生素提供了理论依据。
然而，本实验只考虑了细菌的耐药性，未考虑其他因素如表面结构或基因突变等对细菌耐药性的影响。
未来的研究可以将这些因素纳入考虑，将药物敏感性检测方法与其他手段相结合，深入探究细菌耐药性形成的机制。
细菌耐药表型检测
细菌耐药表型检测细菌耐药表型的检测细菌耐药机制：1.产生药物灭活酶：细菌通过耐药因子可产生破坏抗生素或使之失去抗菌活性的酶，使药物在作用于菌体前即被破坏或失效。
水解酶：主要是β内酰胺酶，包括广谱酶、超广谱酶、金属酶、AmpC酶。
钝化酶：氨基糖苷类钝化酶，使氨基糖苷类抗生素分子结构发生改变，使药物不易进入细菌体内。
修饰酶：2．抗菌药物作用靶位的改变：细菌通过改变药物作用靶位的结构来降低药物和细胞靶位的亲和力，引起对抗菌药物的耐药性。
如细菌可改变青霉素结合蛋白（PBP S）的结构，降低与β—内酰胺类抗生素的亲合力，减少细菌与β—内酰胺类抗生素的结合，从而对β—内酰胺类抗菌药物耐药。
3.细菌细胞膜通透性改变：抗菌药物不易进入由于细菌细胞壁或细胞膜通透性的改变，致使抗菌药物无法进入细胞内而发挥抗菌作用。
细菌可改变细胞壁的孔蛋白通道，使青霉素类、头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素不能进入菌体；4.细菌将抗菌药物泵出细菌细胞外（外排泵）：细菌还可合成新的蛋白插入细胞膜即产生新的膜转运系统，对抗菌药物产生外排作用，近年来发现了许多临床常见致病菌具有与其多重耐药相关的主动外排系统或外排泵，如绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、淋球菌等，促使抗菌药物快速从菌体排出，从而导致细菌的耐药性。
总之,细菌耐药性机制是一个相当复杂的问题，其中，细菌产生灭活酶或钝化酶引起的耐药性在临床上具有重要意义。
多重耐药菌往往综合上述几种耐药机制，使之对许多抗微生物药物产生耐药。
细菌耐药性的发生和发展是抗微生物药物的广泛应用，特别是无指征滥用的后果。
一、β-内酰胺酶检测使用范围：葡萄球菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡它莫拉菌。
方法：头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌（G+菌可直接挑待测菌；G-菌提取细菌裂解液）于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。
临床意义：若β-内酰胺酶阳性，则提示:流感、淋病、卡它对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药葡萄、肠球对青霉素、氨基、羧基、脲基青霉素耐药对产该酶的菌株禁止应用青霉素类、广谱青霉素类抗菌药物，应根据药敏试验结果应用含酶抑制剂药物或头孢菌素联合氨基糖苷类或氟喹诺酮类，根据情况可选用糖肽类及碳青霉烯类抗菌药物。
细菌耐药表型的检测方法
四、金属β-内酰胺酶的表型检测方法
1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平 板上。 （2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片 中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙 酸，35℃孵育18-24h。 （3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大 于单个头孢他啶的抑菌圈（≧4mm），则为阳性，即产金 属β-内酰胺酶。
附：鉴定卡他球菌方法
1.40%KNO3浸湿滤纸条，贴于羊(马)血平板上，周 围点种待测菌，如果菌落周围出现大的绿色环 ， 即为阳性。 2.丁酸酯酶检测法：购买丁酸酯酶检测纸片(梅里埃 公司生产)，涂细菌于纸片上，如几分钟内出现绿 色为阳性。
金属β-内酰胺酶的表型检测方法
2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H 平板上。 （2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚 胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h。 （3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性， 即产金属β-内酰胺酶。
耐药机制 红霉素 克林霉素 基因型 ―――――――――――――――――――――――
泵出(MS) 核糖体基因诱导变异 （ermC为主） 核糖体基因结构变异 （ermA为主） R (iMls) (cMLS) S R R MSRA D-Test(+) R
―――――――――――――――――――――－－
七、其它耐药表型检测 1.MRSA，MRCNS 2.VRE 3.PRP 4.泵出机制：美平/泰能（MIC）≥1
抗菌药物敏感性试验
方法：
菌液制备：生理盐水校正测试菌和质控菌至 0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释到 107CFU/ml；
加菌液：用微量加样器取0.1ml稀释菌液由低 到高加于各排试管中，其最终的接种量为 5×105 CFU/ml。测试菌排、测试菌生长对照 管加测试菌液；质控菌排、质控菌生长对照 管加质控菌液。
实验内容
常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测 方法介绍。
纸片扩散法。 肉汤稀释法。
一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药 检测方法介绍
纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测
耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等
二、纸片扩散法（K-B法）
原理：
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上， 纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周 围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度 范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抗菌药物
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 红霉素 克林霉素 磺胺药
纸片含药量
10U 1μg 30μg 10μg 15μg 2μg 1.25/23.75μg
耐药 ≤28 ≤10 — ≤12 ≤13 ≤14 ≤10
抑菌圈直径(mm)
中介
敏感
—
≥29
11～12
≥13
—
≥15
13～14
≥15
14～22
≥23
涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多 余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转 平板60º，最后沿平板内缘涂抹1周；
细菌药敏试验及耐药机制研究进展
二、药敏试验基本条件
（1）对于从粪便中分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试 和报告氨苄西林，一种喹酮类药和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。此 外对于胃肠外分离的沙门菌属还一定要测试并报告氯霉素及 其某一种Ⅲ代头孢菌素的结果。
（2）所有确认产ESBLs的菌株应当报告为耐所有青霉素类， 头孢菌素类和氨曲南。
•（2）肠球菌心内膜炎要求大剂量青霉素或氨苄西林，或万古霉 素或替考拉宁联合庆大霉素或链霉素以增加杀菌作用。
（3）庆大霉素和链霉素筛选试验，能够预测氨苄西林、 青霉素或万古霉素与一种氨基糖苷类抗生素之间的协同 效应。其它的氨基糖苷类不需进行测试，因为它们对肠 球菌的活性并不优于庆大霉素和链霉素。
（4）对血和脑脊液分离株推荐用头孢硝噻吩β-内酰胺 酶试验。β-内酰胺酶试验阳性提示青霉素耐药，同时也 对酰胺基，羧基和脲基青霉素耐药。
细菌药敏试验及耐药机 制研究进展
2020年7月12日星期日
一、药敏试验种类
1、 纸片扩散法 2、稀释法 稀释法包括宏量肉汤稀释法(macrodilution test)、微 量肉汤稀释法(microdilution test)、琼脂稀释法(agar dilution test)。 3、E-test法
3.D试验-克林霉素诱导耐药试验
（1）机制：对大环内酯耐药的葡萄球菌可能有 天然或诱导性对克林霉素的耐药[通过erm 基因 编码的23S rRNA 甲基化也称为MLSB（大环内 酯、林可和B 型链阳霉素）耐药]，或只对大环 内酯类耐药（由msrA 基因编码的外排机制）。
（2）方法：MHA或血平板，纸片相邻试验， 对于葡萄球菌，距红霉素纸片（15μg/片）边 缘15~26mm 处放置克林霉素纸片(2μg/片)来进 行检测；对于β-溶血链球菌，将克林霉素纸片 (2μg/片)和红霉素纸片（15μg/片）贴在相邻 的位置，纸片边缘相距12mm。
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and Laboratory Standards Institute) 每年修订更改
包括质控 新药的判定标准
特殊耐药性的检测
13
CLSI的法规
规定纸片含量、接种浓度、培养基、平
皿厚度、判定标准、质控；
规定常规测试报告的抗生素；
不同的药判定标准不同； 不同的菌判定标准也不同。
肺炎链球菌
青霉素，红霉素 复方磺胺 氧氟沙星，四环素 万古霉素 氯霉素，利福平 利福平，四环素
二级
三级
17
预报用药(一)
测试药
菌名
所有（除葡
推测其他药物的敏感性
所有β-内酰胺类 多西环素，米诺环素
苯唑西林 葡萄球菌 四环素
萄球菌和不
动杆菌〕
红霉素 克林霉素
G＋球菌
所有
罗红霉素，克拉霉素，
纸片扩散法
3.
4. 5.
6.
用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液； 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度； 最后沿平板内缘涂抹1周； 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配 器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm， 纸片距平板内缘大于15mm。
三级
常规测试并报告的药物分组(2)
葡萄球菌
一级 二级 三级
肠球菌
苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林 红霉素类 万古霉素 克林霉素，万古霉素 氯霉素 庆大霉素
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常规测试并报告的药物分组(3)
流感嗜血杆菌
一级 氨苄西林，青霉素 复方磺胺 头孢呋肟，头孢噻肟 头孢他啶，氯霉素 阿奇霉素，头孢克罗 环丙沙星，亚胺培南
疗反应率低于敏感株
药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效
药敏试验的方法学
半定量…纸片扩散法 (抑菌圈直径)
MIC法：
稀释法(肉汤、琼脂) 自动化仪法 抗生素连续梯度法 (Etest ) 流式细胞仪
纸片扩散法（Kirby-Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼
床医生选择合适的药物，避免产生或加重细 菌的耐药； 监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握 耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药 菌感染的发生和流行。
药敏试验
MIC：在与微生物生长速率有关的特定
时间间隔内，通常是18～24小时，能够 抑制被测菌生长的最低药物浓度。
敏感性分类(CLSI的定义)
敏感（Susceptible）
用常规用量治疗有效 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的
MIC 5倍以上。
耐药（Resistance）
用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
敏感性分类（2）
中介 (Intermediate)
MIC接近血、体液中药物的浓度，治
阿奇霉素 林可霉素
18
预报用药(二)
测试药
氨苄西林 青霉素G
菌名
肠球菌 葡萄球菌
推测其他药物的敏感性
青霉素 氨苄西林，美洛西林
替卡西林
头孢噻吩
肠杆菌科
头孢拉定，头孢氨苄 头孢克罗
奈啶酸 万古霉素
2017/10/10
肠杆菌科 所有
所有氟喹诺酮类 替考拉宁
19
药敏试验-稀释法
以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进
宽度范围；
将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，
围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交 点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。
E test 法
细菌生长 区
E test 塑料 条
256 128
椭圆形 细菌生长 抑制区 判读抑菌浓度 （MIC ug/ml)
wanghui-ART 22
8
016
2017/10/10
E test 法
菌液制备及接种均同纸
片扩散法。
90mm平板上可放E试验
试条1 ～ 2条，140mm 平板最多可放6条。
孵育温度及时 法
优点
连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 影响因素少，稳定性高 操作简单，省时
脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后 不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无 菌生长的透明圈即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，
并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。
纸片扩散法
1. 2.
水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，做成琼脂厚度 4mm，直径90mm的平板； 挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中， 振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。
细菌药物敏感试验及 其耐药表型检测
沙湾县人民医院检验科 张伟荣
抗菌药物敏感试验
测定抗菌药物在体外对病原微生物有无
抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏
感性试验（Antimicrobial Susceptibility
Test），简称药敏试验（AST）。
药敏试验的意义
预测抗菌治疗的效果；
指导抗菌药物的临床应用； 发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临
纸片扩散法
7.
35℃孵育16～24小时量取
抑菌圈直径；
8.
根据抑菌环的直径，按照
CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
纸片扩散法－影响因素
MIC 接种菌量 细菌生长率 抗生素含量、扩散性 平皿厚度 温度，预孵育时间
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纸片扩散法－标准化
CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical
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常规测试并报告的药物分组(1)
一级 二级 肠杆菌科 氨苄西林 头孢唑林，庆大霉素 阿米卡星 氨苄西林/舒巴坦 阿莫西林/克拉维酸 头孢呋肟，头霉素 头孢噻肟，头孢曲松 环丙沙星，亚胺培南 替卡西林，哌拉西林 氨曲南，头孢他啶 卡那霉素，奈替米星 妥布霉素 四环素，氯霉素
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绿脓和非肠杆菌科 头孢他啶，庆大霉素 替卡西林，哌拉西林 阿米卡星 头孢吡肟，头孢哌酮 氨曲南 环丙沙星，亚胺培南 替卡西林/克拉维酸 妥布霉素，复方磺胺 头孢曲松 氯霉素，奈替米星
行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培 养后观察其最低抑菌浓度。
稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培
养基者为肉汤稀释法。
E test 法
E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固
定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗 菌药物，另一面有读数和判别的刻度；
抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的