基因测序技术简介

DNA 测序技术作为人类探索生命秘密的重要手段之一，对生物、生命科学、医学等领域的技术发展起到了巨大的推动作用。自从诞生以来，DNA测序技术的发展经历了几代技术的变革。第一代技术使用的是1977年Sanger等人发明的链终止法或Maxam和 Gilbert发明的链降解法，因为其超高精度并可以从头测序、从头组装的特点，以此为基础的毛细管电泳测序方法在特定领域仍有着不可取代的作用。Sanger 法的缺点是：1、测定步骤繁琐。一个步骤重复四次，因此需要大量相同的DNA 拷贝，样本需求量大；2、不能测定太长的DNA 序列。

第二代技术作为目前市场上主流的DNA测序技术较第一代测序技术而言，测量通量明显提高。如Roche454公司的GS FLX基因测序系统，Illumina公司的HiSeq/MiSeq/Genome Analyser系统，Life Technologies公司的5500xl SOLiD系统。此外，被称为第2.5代的Helicos公司的HeliScope系统在第二代测序技术的基础上引入了单分子测序的概念，在速度和成本方面较之前有了一定进步。

第三代技术以Pacific Biosciences公司的RS系统为代表，以单分子实时测序为主要特点，对零模波导中的单个荧光分子进行高灵敏度检测，从而快速获得 DNA序列信息。虽然第二代测序技术已经取得广泛应用，但是其必须基于PCR扩增，成本、准确性等关键问题仍然存在，科学家正在致力于新的测序解决方案。目前以单分子测序为主要特征的第三代测序技术（也称为Next-generation sequencing）已经初现端倪。目前比较看好的有：（1）生物科学公司（BioScience Corporation）的Heloscope 单分子测序技术。Heloscope 单分子测序技术也是基于“边合成边测序”的思想，但是不需要PCR 扩增，所以更能反映样本的真实情况，通量也更高。（2）太平洋生物科学公司（PacBio）的SMRT 技术。SMRT测序的核心是SMRT 芯片，为一种多ZMW 孔的厚度为100nm 的金属片，测序时将DNA 聚合酶、不同荧光标记的dNTP、待测序列加入ZMW 孔的底部，然后进行合成反应。荧光标记为磷酸基团，一个dNTP 加入到合成链上和进入ZMW 孔同步进行，被激光束激发，依据荧光的种类判断dNTP 的种类，后用氟聚物切割、释放，离开信号检测区口。

纳米孔测序技术属于第四代测序技术，其通过物理方法，无需生物化学预处理而直接对DNA序列进行读取，正向着高通量、高读长、低成本、小型化的方向发展。

纳米孔测序方法不同于其他测序方法, 不需要对 DNA 进行生物或化学处理, 而采用物理办法直接读出 DNA 序列. 其原理可以简单的描述为: 单个碱基通过纳米尺度的通道时, 会引起通道电学性质的变化. 理论上, A, C, G, T 4 种不同的碱基化学性质

的差异会导致它们穿越纳米孔时引起的电学参数的变化量也不同, 对这些变化进行检测可以得到相应碱基的类型。

目前用于DNA测序的纳米孔可以大致分为2类生物纳米孔和固态纳米孔。由于DNA 链的直径非常小(双链DNA直径约为2nm，单链DNA直径约1nm)，所以对所采用的纳米孔的尺寸有着近乎苛刻的要求。生物纳米孔多采用的是α溶血素(一般嵌入在双层脂膜当中)，其最窄处直径尺寸约为1.5nm，恰好允许单链DNA分子通过，并且大小严格一致。

然而生物纳米孔在膜稳定性、电流噪声等方面的问题在一定程度上限制了其发展。牛津纳米孔公司在蛋白纳米孔的应用方面取得了一定进展，他们的GridION和MinION系统就是基于蛋白纳米孔的测序平台。固态纳米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成，一般使用离子束或电子束在硅或其他材料薄膜表面钻出纳米尺度的孔洞，再进一步对孔的形状和大小进行修饰而成。

相比于生物纳米孔，固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势，但是因为受限于如今的半导体工艺制造水平，固态纳米孔的制造还较为复杂与昂贵。

固态纳米孔工艺

固态纳米孔的制作与半导体工艺的结合使得DNA测序芯片的大规模生产成为可能。2001年，Li等人使用聚焦离子束在Si3N4薄膜上制作出了直径61nm的孔，随后又采用Ar将孔径缩小到了1.8nm。2003年，Storm等人用高能电子束在SiO2薄膜上制作出了直径2nm的孔。如今，人们已经可以在很多材料上制作出亚10纳米尺度的固态纳米孔，例如，SiN x，SiO2，SiC，Al2O3等。此外，石墨烯因其本身超薄的结构和特殊的电子特性也作为薄膜材料的一种新选择，它的超薄的单原子层结构十分适合隧道电流的测量。

纳米电极的制作在测序用纳米孔制造工艺中也是一项重要的挑战。前文提到，纳米电极的形状、与纳米孔重合度的好坏直接影响到电流信号的好坏，因此要在纳米尺度制作出形状规则、电学特性良好的电极并不容易。

目前研究者们所做的工作都是在实验室中对单个纳米孔进行研究，而无法将其运用到商业中。到目前为止，还没有办法能够快速制作出直径大小均一且都在5nm以下的纳米孔阵列，在DNA测序芯片向商业化转变的道路上，这是必须解决的一个问题。但是，相信随着半导体制造工艺和纳米电子学的不断发展，人们一定会制作出高质量的纳米孔芯片。

目前具有较好商业应用前景的技术主要有牛津纳米孔技术公司（Oxford Nano-pore technologies）的蛋白纳米孔测序技术。其主要采用蛋白纳米孔测序技术，利用α溶血素制成的纳米孔，用核酸外切酶切割单链DNA，切下的单个碱基进入纳米孔，流过纳米孔的电流强度被瞬间影响，电流变化振幅代表每个碱基的特征。

面临挑战与发展前景

虽然纳米孔测序的优点十分明显，与前几代技术相比在成本、速度方面有着很大优势，但是目前还处在起步阶段，从测序原理到制造工艺都存在有许多问题，许多技术也都只停留在理论阶段。

固态纳米孔测序技术作为新兴的第四代 DNA测序技术，具有低成本、高读长、易集成等优势。如今，随着半导体工艺技术的飞速发展，小型化、高速度、大通量的纳米孔测序芯片的实现成为可能。相比传统的测序技术，固态纳米孔测序技术在成本、速度等方面有着十分巨大的优势。然而，作为一种新兴的测序技术，固态纳米孔在制造、测序、集成等方面也存在着诸多挑战.