目的基因与载体的

OXOID 产品; 卡那霉素( Kan) 、 头孢霉素 ( Cef ) 、 利福平( Rif) 、 链霉素( Str ) 、 玉米 素( ZT) 、 3-吲哚乙酸( IAA) 1． 3 PCR 引物设计及合成 根据本项目前期已 经克隆的苹果 PGIP 基因序列设计 1 对引物， 分别为 PGIP 基因的上 下游特异引物， 命名 为引物 1 和引物 2 引物 1 和 2 的序列分别为 CTGGATCCATG-GAACTCAAGTTCTCC 和 TTGTCGACTTGCAGCTT-GGGAG， 下划线 部分分别为 Sal BamH 酶切位点， 引物生工 合成公司购买。 1． 4 植物材料及培养基组成 试材为番茄中蔬
多种作物上已有成功的报道 Toubart 等 分离和克隆 了编码菜豆 PGIP 的基因， Desiderio 等［14］首 次 将大豆 PGIP 基因置于烟草花叶病毒启动子的诱导 之下， 构建了植物表达载体， 并对番茄 烟草和大 豆进行转化， 部分转基因番茄对镰刀菌( Fusarium) 有抗性， 苹果 PGIP 基因转基因烟草能抑制苹果真 菌Btryosphaeria obtusa 和 Diaporthe ambigua 以 及羽扇豆炭疽病原真菌 PG， 李广平等［15］将梅 的 PGIP 基因构建了植物表达载体， 并对烟草进行 了转化 Ben-net 等［16］ 成功的将对真菌具有抑制 作用的梨的PGIP 基因转入到番茄中， 并得到了高 效表达， 且使番茄对易感真菌( Botrytis cinerea) 的 抗性得到明显加强。
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37℃振荡培养过夜， 用碱裂解法小量提取质粒， PCR 检测质粒 DNA 中有无目的基因片段插入， 以 PGIP 基因克隆载体为正对照 同时用 Sal BamH 双酶切质粒， 检查有无目的片段插入 PCR 扩增 反应条件: 94℃ 预变性 5 min; 94℃ 45 s， 58℃ 45 s， • 72℃ 90 s， 15 次循环; 94℃ 45 s， 64℃ 45 s， 72℃ 90 s， • 35 次循环; 72℃保温 10 min， 4℃保存 PCR 产物 和 • 酶切产物分别进行 1. 0% ( W/V) 琼脂糖凝胶电泳
• 1． 2． 3 表达载体导入农杆菌 农杆菌 EHA105 感受态细胞的制备， 按文献［4］的 方法进行， 表达载体 导入农杆菌采用冻融法［4］， 在含 Str 50 mg /L、 Rif 20mg /L、 Kan 50 mg /L 的 LB 固体培 养基上筛选阳性农杆菌克隆。 1． 2． 4 工程农杆菌鉴定 随机挑取抗性单菌 落， 分别接种在附加 Kan 50 mg /L Rif 20 mg /L Str 50mg /L的 LB 液体培养基中， 28℃振荡 培养过夜， 碱裂解法小量提取转化质粒， PCR 扩增检测 PGIP 基因，PCR 反应条件同 上。
本试验通过农杆菌介导法将苹果 PGIP 基导 入到栽培番茄中蔬四号中， 旨在通过 PG基因因在 件， 也为下一步转化其他植物奠定基础， 同时也 丰富 番茄体内的高效表达为其抑菌功能验证创造良好条 了番茄抗真菌育种的基因资源。
• 材料和方法 1． 材料 1． 1菌株和质粒 大肠杆菌菌株 E． coli DH5植物 中 间 载 体 质 粒 pWR306 根 癌 农 杆 菌 菌 株 EHA105 及克隆有 PGIP 基因的克隆载体质粒 pMD18T 均为本实验室保存． 1． 2 化学试剂和工具酶类 Taq DNA 聚合酶dNTP 限 制性内切酶 Sal BamH T4 DNA 连接酶 DNA 分 子 量 标 准 DL2000; DNA 片段凝胶回收试剂盒; 质粒微量 抽提试剂盒; 琼脂糖为 In-vitrogen 产品; 胰蛋白胨 酵 母提取物为 ENGLAND
四号种子无菌苗叶片及茎段， 基本培养基为 MS 培养基， 各培养基附加蔗糖 30 g /L， 琼 脂 8 g /L， pH 调至 5. 8 分化培养基为 MS + ZT 1. 0 mg /L + IAA 0. 1mg /L; 筛选培养基为 MS + ZT 1. 0 mg /L + IAA 0. 1mg /L + Kan 100 mg /L + Cef 500 mg /L; 继代培养基为 MS + ZT 1. 0 mg /L + IAA 0. 1 mg /L + Kan 50mg /L + Cef 500 mg /L; 生根培养基为 MS + IAA 0. 1mg /L + Kan 50 mg /L + Cef 300 mg /L。
• 1． 2 方法 1． 2． 1 PGIP 基因植物表达载体的构建 用 SalⅠ、 BamHⅠ分别双酶切植物表达载体 pWR306 和 PGIP 克隆载体 pMD- 18T， 琼脂糖凝胶电泳后用胶回收 试剂盒回收目的基因片段和线性化的植物表达载体片 段。用 T4 DNA 连接酶 16℃ 下连接 12 h， 将目的 基因片段插入酶切回收后的植物表达载体的 SalⅠ、 BamHⅠ位点之间， 连接产物转化大肠杆菌 DH5α， 用含有 Kan 50 mg /L 的 LB 平板筛选抗性克隆。 1． 2． 2 重组质粒的鉴定 随机挑取抗性单菌落， 分 别接种在加有 Kan 50 mg /L 的 LB 液体培养基中，
形成一种高亲和复合物， 从而抑制病原菌 Endo- PG的活性，抑制真菌对植物细胞壁的 降解， 维持植物细胞壁的完整性; 此外， 两 者相互作用会导致大片段寡聚半乳糖的积累， 而该物质能进一步激发植物防卫系统， 引发 植物自身多种防卫反应， 增强植物抗性。 PGIP 被认为是植物先天免疫系统的成分，在 植物抗病育种中， PGIP 已成为关注的焦点之 一。PGIP- PG 相互作用已成为在分子水平上 研究植物富含亮氨酸的重复单位( Leucinerich repeatLRR) 介导的特异识别的一种模式 系统。因此， PGIP 基因在植物抗病基因工程 以及蛋白相互作
• 1． 2． 5 PGIP 基因农杆菌介导转化番茄 以番茄中 蔬四号无菌苗叶片及茎段为受体， 横向划伤， 背面 向上接在 MS 培养基上， 黑暗条件下预培养 2 d 之后 将叶片及茎段用 OD600 值为 0. 5 的菌液侵染 20 min，共培养 3 d 共培养完成后将叶片转移到附加 Kan100 mg /L 及 Cef 500 mg /L 的筛选培养基上， 暗培养21 d 再进行光培养， 每 14 d 换一次培养基 分 化出不定芽后， 切下转入继代培养基继续进行抗性筛 选 1． 2． 6 转基因植株的 PCR 检测 剪取抗性植株和 对照植株的叶片， 采用 CTAB 法提取植物基因组 DNA， 用 PGIP 基因特异引物进行 PCR 检测 目前， 国内外对 PGIP 基因的分离 PGIP 在植物抗病中的作用以及在 抗病育种中的应用已进行了深入的研究， 并取得了 一定的进展番茄是一种常见的用于转基因和基因功能 研究的模式植物， 农杆菌介导的转基因方法体系已 经非常成熟， 同时其遗传研究也相对较为深入， 为 通过转基因技术研究外源基因的功能提供了良好的平 台真菌病害在番茄上特别常见， 主要有早疫病 晚疫 病 绵疫病和灰霉病等 利用基因工程技术将外源抗真 菌病的基因导入番茄， 一旦证实其对病原真菌具有 抗性， 可作为抗病育种的材料或者抗病品种加以应 用 利用 PGIP 基因转基因培育抗病品种， 在
目的基因与载体的连接与转化
组名：二大组6小组 组长：邱文霞 组员：黄瑞、赵中先、杨 士芮、王彦、王珏 时间：2012-5-10
植物细胞壁是病原真菌在侵染过程中所遇到的 第一道防线， 植物病原真菌可分泌一系列的酶 来降解植物细胞壁内切多聚半乳糖醛酸酶 ( Endo-PG) 是病原真菌侵染寄主时分泌的第一 个酶，PG 对植物细胞壁的降解使其他细胞壁 降解酶对其底物的攻击变得更容易， 同时也为 真菌的生长和发育提供了糖源［6］， 它可以 降解植物细胞初生壁中的多聚半乳糖醛酸及其 部分甲酯化衍生物， 从而导致细胞液的外渗， 诱发植物发病［7］ 然而， 植物产生 的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 ( Polygalacturonase-inhibiting proteins， PGIP) 能够与病原菌的 Endo- PG