药理实验方法学重点缩印

方法学1.白细胞分化抗原群的检测方法P170答：(1)免疫组化技术先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成的有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。

(2)免疫荧光技术根据抗原抗体反应的原理，现将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

(3)流式细胞技术使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微利捉个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表向前散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图和加三维结构图像进行分析。

2.分析白细胞分化抗原检测的影响因素流式法检测的影响因素：（1）非特异性结合NSB①Fc受体结合抗体是导致影响检测结果的重要因素，任何细胞上只要存在未结合的Fc受体，都可能有NSB。

采用高浓度的纯化IgG可用于阻断Fc受体的NSB。

②免疫球蛋白聚集可增加NSB。

由于冰冻、复溶和冻干处理，抗体均可出现聚集。

对于新购买的抗体，可通过高速离心去除聚集。

3.简述实验动物血压测定的方法。

P140一、直接测定法1.麻醉动物直接测定法（1）麻醉动物直接测定法：麻醉、固定动物、手术视野剪毛、气管插管、动脉插管、血压记录；清醒动物直接测定法（2）简易清醒自由活动大鼠血压测定技术：导管制作、手术操作、连接测压系统、记录血压（生理记录仪记录）：（3）计算机化清醒自由活动大鼠血压测定技术：①采样、记录和储存：压力信号经换能器转换为电信号，再经放大器输入计算机。

②数据处理和结果分析：（4）清醒自由活动大鼠血压遥控测定技术二、间接测定法 1.容积测定法（1）大鼠尾容积测定法大鼠尾根部加压超过收缩压时，血流中断，当压力降低到等于或稍低于收缩压时，血液流入尾部，此时的压力大于静脉压，血液回流受阻，结果尾容积加大，测定该容积突然增加时的瞬间压力，即为收缩压：（2）大鼠足容积测定法同上；2..脉搏测定法（1）大鼠尾动脉脉搏测定法大鼠尾根部加压超过收缩压时，脉搏消失，压力减至收缩压时，脉搏出现，继续减压之舒张压时，脉搏回复加压前水平，检测这种脉搏变化时的瞬间压力，即得血压值。

（2）犬颈动脉脉搏测压法同上；（3）犬胫动脉脉搏测压法同上（4）犬尾动脉脉搏测压法同上4.简述肾外包扎性高血压模型制备的基本原理和注意事项。

P144原理：肾外异物包扎，可致肾周围炎，在肾外形成一层纤维素性鞘膜，压迫肾实质，造成肾组织缺血，使肾素形成增加，进而使血液中血管紧张素含量增加，血压上升。

注意事项：（1）肾外包扎材料除自制双层乳胶薄膜和玻璃纸外，还可用绸布、乳胶、火棉胶等材料。

肾外包扎材应足够紧，但不能勒破组织。

（2）如果要制造2肾1扎型，则一侧肾包扎后无需切除另一侧肾，术后3~6月10%~20%动物形成高血压。

如果要制造2肾2扎型，则一侧肾包扎后同法包扎另一侧肾，术后3~4周70%以上动物形成高血压。

5.试述区分中枢降压与外周降压的试验方法。

P145（1）脊髓猫实验将猫在第二颈椎水平切断脊髓，施行人工呼吸，随后切断两侧迷走神经。

如果给药后仍有降压作用，提示作用部位不在中枢，而在外周。

如果给药后原有的降压作用消失，提示作用部位在中枢。

（2）降压有效量比较实验如果以静脉注射最小有效降压计量的1/10量作椎动脉注射或侧脑室注射，仍可引起降压效应时，则可推测该受试药物降压作用为中枢性，否则尾外周性。

（3）交叉灌流实验通过交叉灌流实验记录受血动物的血压及交感神经活动来分析药物的中枢性心血管作用。

受血动物的头部血供由另一供血动物提供，在供血动物注射药物后，若药物通过中枢发挥作用，则受血动物会立即出现类似供血动物的心血管效应和交感神经活动的改变。

6.发热模型的建立与评价1.基本原理：发热反应大多是各种致热因子作用于机体，产生和释放内热原，并进一步影响体温调节中枢，使调温起步点提高，体温相应升高。

因此，实验室常用有关的刺激因子激活产生内热原。

操作方法：1测量体温，系将肛表涂上凡士林，使其润滑后插入动物肛门，兔一般插入3-4cm，大鼠插入2cm，放置3-5min后取出读数。

2.引起发热反应包括（1）细菌培养液和内毒素引起的发热。

①注射杀死的大肠埃希菌或乙型副伤寒沙门菌培养液②注射伤寒-副伤寒菌苗③注射腐败干草浸剂④注射大肠埃希菌菌液⑤注入伤寒沙门菌内毒素⑥应用啤酒酵母悬液（2）非感染性发热复制法1）化学刺激法：给兔背部注射松节油0.4ml/kg或2%2,4-二硝基酚乙醇溶液亦用1%角叉菜胶0.1ml，于大鼠一侧后足趾皮下注射2）注入异性蛋白给兔肌注10%蛋白栋，剂量1.0g/kg，可在2-3h内引起体温显著升高3）温刺激法（3）实验性发热反应的影响因素①动物特点的影响：不同种属、年龄和形态特征，对发热有明显影响②实验环境温度的影响：实验环境的温度能明显影响发热的反应速度和强度③实验动物活性的影响：体温实验时，必须考虑到动物的活动情况④致热物质的注入量和注射部位。

7.痛反应标准1、刺激强度和部位明确；2、有痛感觉产生的潜伏期；3、反应优先发生于伤害性刺激痛觉感受范围内，可根据刺激强度对反应分级；4、痛反应的量化值必须能反应镇痛药的量效关系。

8.疼痛模型建立方法1、化学刺激法：小鼠扭体法，钾离子皮下透入法，缓激肽动脉注射法，福尔马林实验2、热刺激法：辐射热刺激法，小鼠热板法，小鼠热水缩尾法；3、机械刺激法：大鼠尾尖部压痛法，小鼠尾根部加压法，后肢加压法（大鼠压足法）4、电刺激法：1.大鼠牙髓刺激法 2.电刺激大鼠甩尾法9.慢性疼痛模型慢性疼痛法：1.大鼠关节炎痛 2.神经源性疼痛 3.坐骨神经痛 4.癌痛模型10.镇痛药物作用部位分析基本原理：1）微量给药，直接给药部位达有效浓度，而经血流稀释分布至其他部位时则浓度太低而无效；2）阻断或改变血流使药物不能进入某一部位或只能到达某一部位；3）切断部位之间解剖学联系；4）造成对称肢体痛阀差别，根据差别与部位的关系分析药物的作用部位。

1、外周疼痛模型：大鼠单足致炎法（中枢和外周疼痛模型），大鼠诱发肌电法，痛介质诱发隐神经传入放电法，兔耳静脉阻断法2、中枢疼痛模型：清醒小鼠鞘内注射（脊髓），大鼠蛛网膜下腔插管法（脊髓），侧脑室给药法（中枢），脊髓化鼠模型（中枢），大鼠单足致炎法（中枢和外周）。

11.肝纤维化动物模型1、CCL4诱发的肝纤维化动物模型原理CCL4−−−→−酶肝450PCCL3.+ CL.启动脂质过氧化作用损伤肝细胞操作：SD大鼠、CCL4、花生油（高压灭菌）分组：正常组、模型组、不同剂量的受试药物组、阳性对照药组背部皮下注射CCL42、异种血清诱发的肝纤维化动物模型原理：异种血清进入动物体内引起免疫应答形成抗异种血清的抗体，长期刺激产生的免疫复合物来不及清除，沉积于肝脏的血管壁内外。

操作：wistar雄大鼠、猪血清分组：同上每只腹腔注射，，每次注0.5ml,每周2次，16周→给药组给予相应药物→血清，肝脏指标检查3、胆总管结扎致肝纤维化动物模型4、乙醇诱导的肝纤维化动物模型5、二甲基硝胺诱导的肝纤维化动物模型6、复合因素建立的肝纤维化动物模型12.人外周血、DC分离培养及鉴定方法培养流程：1、静脉新鲜抗凝血50ml 2、密度梯度离心获得单个核细胞3、接种至6孔平底培养板中，置37度，5%二氧化碳培养箱吸弃细胞悬液，获得贴壁的单核细胞4、分离成功的单核细胞于每孔加入10%胎牛血清的1640完全培养基，重组人GM-CSF20ng/ml和IL-4 20ng/ml，于培养第3天半量换液同时加入全量细胞因子，于培养第5天全量换液，加入全量细胞因子，于培养第七天收获。

鉴定方法：13.要进行某药物的药效试验，观察其对血压的影响，应分别选用何种实验动物为好？不能选择哪种动物？为什么血压研究常用实验动物为大鼠、犬和猫，一般不宜使用兔作为血压实验，因为兔血压易波动，对药物反应与人相差较大。

14.MTT、CCK-8检测细胞增殖的基本原理和操作步骤MTT法原理：活细胞线粒体酶还原成黄色，MTT为显蓝色的不溶于水的甲臜，死细胞此现象消失，MTT不被还原；DMSO溶解甲臜后，可通过酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm处测定其吸光度（OD值）。

吸光度值与活细胞数成正比，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物一直或杀伤肿瘤细胞的能力。

操作步骤：称取一定量MTT，加PBS或无血清培养基配置，用0.22um滤膜过滤，5mg/mlMTT液避光保存。

接种细胞→24h→溶剂对照组/待测实验组（五个稀释浓度）→培养结束前4h→每孔加MTT溶液20ul→37度孵育4h，吸弃上清→加DMSO→测定570nm OD值计算:抑制率=[（对照组OD均值—给药组OD均值）/对照组OD均值]*100%cck-8法原理：类似于MTT化合物，在电子耦合剂存在的情况下，可被线粒体脱氢酶还原成黄色的水溶性甲臜，生成甲臜数量与活细胞数成正比，活细胞增殖越快，颜色越深；细胞毒性越大，颜色越浅。

操作：接种细胞于二氧化碳环境中培养24h→溶剂对照组/待测实验组（5个稀释浓度）→没空加cck-8溶液10ul→37度培养1至4小时→450nm处测OD值和计算抑制率。

优点：1、加入cck-8可直接测定OD，简单方便，同时减少误差，尤其适用于悬浮细胞的培养。

2、由于CCK-8量加入少，建议加完后轻敲培养板混匀。

3、细胞种类不同，形成Formazan量也不同，如果显色不够可以继续培养。

15.Transwell侵袭实验的基本原理、操作步骤原理：肿瘤侵袭基地膜被认为是转移发生过程中的一个重要环节，肿瘤细胞最初穿过基底膜是他们侵入淋巴系统或血床的开始，随后肿瘤细胞通过血行散播或淋巴转移进入靶器官/组织，最终形成转移灶。

Matrigel是从一种富含细胞外基质蛋白的小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤中提取的可溶性的基底膜。

它主要包含层黏连蛋白IV型胶原、硫酸类肝素蛋白多糖等多种基底膜组分。

操作步骤：1)Matrigel胶包被小室的制备；2）胰酶消化法从培养瓶中获取细胞，用含1%FBS的培养基重悬细胞，使细胞浓度达到（1~5）×105个/ml；3）Matrigel侵袭分析；4）结晶紫染色法收集下室细胞，并统计迁移到下室的细胞数。

16请以豚鼠肺支气管灌流方法为例简述肾上腺素和苯海拉明的药理作用机制差异基本原理：离体肺支气管灌流是通过观察药物对灌流液流出速率的影响，借以测定全部气道平滑肌的张力情况。

若使灌流液流量增加，说明气道平滑肌张力减低，即该药有扩张平滑肌的作用。

机制：（1）组胺激动H1受体和乙酰胆碱激动M受体都可导致平滑肌收缩。