生化技术第七章 光学检测技术PPT课件

检测方法
直接检测荧光性物质 利用非荧光物质与荧光试剂反应后检测 在荧光性物质溶液中加入消光物质，测定荧光 的减少 常用物质测定的荧光试剂p183(自学）

思考题

生化中的光学检测方法主要有哪些? 分光光度法如何对物质进行定性定量? 旋光法如何测定光学活性物质含量(计算)? 荧光检测中蛋白质和氨基酸常用的荧光试 剂是什么?
第七章 光学检测技术



利用物质所具有的各种光学性质，对物质 进行定性、定量及结构分析的技术。 包括：旋光检测、析光检测、荧光检测、 分光光度检测、散射光谱检测等。 生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、 荧光பைடு நூலகம்测
一 分光光度检测



又称分子吸收光谱检测，是利用物质分子 所特有的吸收光谱而对物质进行定性定量 测定的检测技术。 紫外分光光度检测（200～400nm） 可见光分光光度检测（400～760nm） 红外光分光光度检测（760～10000nm）


操作要点： （1）样品液的配制 （2）旋光度的测定
旋光法测定味精浓度


样品溶液配制 精确称取味精样品10.00g，加40～50mL蒸馏 水溶解，搅拌加入分析纯盐酸16mL，使味精 全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至100mL。 旋光仪调零 预热10min，放进滤光片。取16mL分析纯盐酸 蒸馏水定容至100mL。装满旋光管，调整零点。 样品液测定 样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品 室，测定旋光度，记录温度。


4 待测物质的定量分析 （1）标准曲线法 注意：对于存在有干扰物质的样品要进 行校正。 （2）Lambert-Beer E=KCL, K-消光系数
二 旋光检测技术



利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质） 对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大 小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋 光检测技术。 旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该 物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称 为旋光度。左旋（－），右旋（＋）。 物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此 外与入射光的波长及温度有关，对溶液而言， 还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关 系。




1 样品溶液的配备 （1）对各种光有选择性吸收特性的物质 （2）本身没有颜色的物质，转变为有色 的物质溶液 2 样品的检测 选择好入射光的波长，空白液调零，测 定。





3 待测物质的定性分析 （1）将样品溶液在一定条件下（pH、温度、 缓冲液等）测得的吸收光谱与物质的标准吸收 光谱相对照，推断样品是什么。 （2）根据样品吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度 之比值，与相当条件下资料所载的比值比较， 推断样品是什么。 如 ATP: OD280/OD260=0.85, OD250/ OD260=0.90 AMP: OD250/OD260=0.85, OD280/OD260=0.22 (3)将分光光度检测与层析或电泳分离技术相配 合，综合判断。


计算 C= α × 100/ ([α ]tλ L) [α ]tλ ＝32＋0.06×（20－t) C味=C×187.13/147.13 味精纯度＝ C味/样品重量
三 荧光检测技术


有些物质的分子吸收了一定波长的光 （辐射能），分子内电子被激发到较高 的能级以后，由于电子旋转或酸离解等 消耗一部分能量，当电子返回到低能级 状态时，重新放出较长波长的光，这就 是荧光。 不同物质放射的荧光光谱不同，荧光的 强度与物质的浓度有关。



溶剂确定后， α ＝[α ]tλ LC/100 α － 旋光度 L －溶液厚度（分米） [α ]tλ －比旋光度，通常采用[α ]20D L －溶液厚度（分米） C－溶液浓度，100mL溶液中所含物质 的克数。 根据物质的[α ]20D 和实际测出的α ，可 计算得到C= α × 100/ ([α ]tλ L)