番茄中果胶酶活力的测定

实验三番茄中果胶酶活力的测定

一、实验原理

番茄中的果胶酶系相当复杂，它主要包括聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶酯酶（PE）两类。聚半乳糖醛酸酶能催化果胶降解，导致果胶溶液粘度下降。因此，可通过测定酶催化反应体系粘度下降的速度来测定它的活力，果胶酯酶能催化果胶分子中半乳糖醛酸单位上的酯键水解，产生游离的羧基和甲醇，导致果胶溶液的pH下降，因此可以用pH—stat法测定它的活力。

二、试剂和仪器

试剂：20%氯化钠溶液、0.05mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液pH4.5（Ⅰ）、1%果胶溶液pH4.5、0.5mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液pH4.5（Ⅱ）、1mol/L 氯化钠溶液、0.1mol/L 氢氧化钠溶液（准确标定）、0.05mol/L 氢氧化钠溶液

仪器：组织捣碎机、抽滤装置、水浴锅、秒表、常规玻璃仪器、奥氏粘度计、pH 计

三、实验步骤

1、酶液的制备

300g番茄+ 100mL20%氯化钠溶液

↓

匀浆

↓ 离心（4℃,10000rpm，20min）

↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓

沉淀上层清液

↓ 抽滤，量取清液体积

↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓

沉淀酶液Ⅰ

↓ 按516g硫酸铵/L酶液（80%的硫酸铵饱和度）

缓慢加入研细的硫酸铵粉末

↓ 离心（40℃,10000rpm，20min）

↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓

上层清液沉淀

↓溶于约10mL0.05mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液Ⅰ

酶液Ⅱ

↓在0.05mol/L醋酸缓冲液Ⅰ中透析（MWCO12000）

透析物

↓离心（40℃,10000rpm，20min）

↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓

沉淀部分纯化的果胶酶溶液

2、PG活力的测定

测定30℃下水的流动时间，3次平行之间相差应小于0.2秒。

将50mL 1%果胶溶液（pH4.5）、20mL0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液和30mL 去离子水置于250mL具塞三角瓶中并充分混和。将三角瓶置于30℃恒温水浴中保温。待温度达到平衡后，测定该混和液的流动时间，计为果胶空白。

移取上述混合溶液20mL到50mL三角瓶中，加入1mL已在同一温度下恒温的酶液，立即混合，开始记录时间。移取10mL反应混和物到已恒温的奥氏粘度计中，在不同的时间间隔连续测定混合体系的流动时间。以流动时间对测定时间作图，并外推求出零点。从直线的斜率计算流动时间降低的速度，以每秒钟流动时间降低的百分数表示果胶酶的活力。

3、PE活力的测定

测定果胶酯酶的装置如图所示。在反应器中加入10mL 1%果胶溶液，2.5mL 1 mol/L氯化钠溶液和10mL去离子水，将恒温水浴温度调节到30℃，采用0.1mol/L NaOH溶液调节体系pH到7.5，然后加入0.5mL酶液，开始计时。不断地加入0.1mol/L NaOH溶液，使溶液的pH保持在7.5±0.3，记录不同反应时间下碱液的累积消耗量。每分钟释放出一个微克当量的羟基定义为1个果胶酯酶活力单位。这里所说的“微克当量的羟基”实际上就是“氢氧根的微克数”。

作NaOH消耗量-反应时间曲线，由直线的斜率计算果胶酯酶活力。

四、数据记录与处理

1、PG活力的测定

空白第一次第二次第三次平均

水空白（秒）43.03 43.18 42.82 43.01

果胶空白（秒）120.40 120.28 120.31 120.33

酶样品活力测定

测定时间（秒）103.24 205.74 335.25 442.61

流动时间（秒）66.59 54.68 49.69 46.32

Fr 3.284 6.704 11.279 23.40

校正测定时间（秒）136.535 233.08 360.095 465.77

由相对流动值Fr=（K Pa-K H2O）/（T-K H2O），所以可以计算出不同测定时间下反应液的Fr值。

以Fr值对校正的测定时间作图，作图如下

可得斜率M为0.0581，所以加入的1mL酶液的活力=0.0581×100=5.81U/mL 2、PE活力的测定

30℃时果胶酯酶活力测定数据如下：（C标准（NaOH）=0.05mol/L）

时间（s）16 59 97 128 碱管读数（mL） 1.42 2.54 3.52 4.22 NaOH消耗量（µmol）71 127 176 211 NaOH消耗量—时间曲线如下：

由斜率为75.398，也就是说0.2mL的酶液作用1分钟所产生的羧基需要75.398µmol的NaOH来中和，即需要75.398×17=1281.766µg的羟基来中和。由每分钟释放出一个微克当量的羟基定义为1个果胶酯酶活力单位，可知酶液中PE的活力为1281.766/0.2=6408.83U/mL。

五、讨论

1、聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶活力测定是在它们的最适pH 下进行的。

2、实验中采用奥氏毛细管粘度计，30℃时去离子水的流动时间应在40~45 秒为宜。从实验结果来看是符合要求的。

3、测定聚半乳糖醛酸酶活力时，酶液浓度应控制在流动时间每分钟下降1s以内。当流动时间下降20%时即可停止实验。

4、测定果胶酯酶活力时，pH范围一般可控制在7.5±0.3。一是为了水解反应顺利进行，二是为了促进酸碱中和能迅速发生。

5、在加入硫酸铵沉淀酶蛋白时，注意缓慢加入，时间控制为30min为宜，这样做是为了防止泡沫的产生。因为酶也是一种蛋白质，其附着在泡沫上，由于泡沫大的表面张力会使酶蛋白变性，导致酶失活，从而影响后续的实验。