活性干酵母的生产

面包酵母液体深层通风发酵实验一、实验目的要求学生掌握通风发酵的基本原理及过程，掌握上罐操作技术，掌握流加补料控制技术。

（1）发酵罐及管路、空气过滤器灭菌操作及发酵罐系统管路的熟悉（2）实罐灭菌—培养基灭菌实验（3）观察并记录酵母菌扩培过程及上罐发酵过程菌种生长变化情况二、实验原理面包酵母（分子式：C3.72H6.11O1.45N0.61+P0.035+K0.051+5.6g其它物质）培养是最典型的细胞物质生产过程。

利用葡萄糖为碳源，通风培养面包酵母的微生物反应过程可用下列化学平衡式表示：6.67CH2O+2.10O2→C3.92H6.5O1.94+2.75CO2+3.42H2O(碳水化合物) (酵母菌体)200 67.2 84.6 121 61.6如果在酵母菌体内再计入除碳、氢、氧以外的其它无素如氮、磷以及灰分，则每200g 碳水化合物约可得到100g干酵母。

即得率约为50%。

在通风供氧充足的前提下，分批补料（流加）培养。

本实验面包酵母培养的目的是获得最大酵母浓度。

因此采用流加培养较为理想。

其原理是所谓的反巴斯德效应（CRABTREE效应）：在酵母培养过程中，糖浓度过高时，即使溶解氧很充足，但由于糖生成乙醇，从而使菌体得率下降的现象。

（1）、分批培养：分批培养是微生物在特定条件下只完成一个生长周期（growth cycle）的方法，即接种少量微生物在一密闭系统中生长繁殖，直到某些营养物耗尽或某些产物积聚到毒害浓度为止。

生长中微生物群体所经历的几个生长阶段分别为迟滞期（lag phase），对数生长期(exponential phase)，稳定期(stationary phase)，死亡期（deathphase）。

胞数对数时间（hr）营养物质（底物）的浓度与组成影响微生物培养的生长速度，对微生物的生长起至限制作用的营养物即所谓的限制性底物。

1949年莫诺（Monod）发现微生物比生长速率与单一限制性底物存在一定联系并借助数学方法建立了著名的经验公式——莫诺方程：μ=μμ—比生长速率，单位菌体在单位时间的增殖量（h-1）μm—最大比生长速率（h-1）Ks—微生物对底物的半饱和常数(g/L)S—单一限制性底物浓底(g/L)在从对数生长期与稳定期变化的过程，可称为减速期，此时细胞比生长速率和限制性期浓度符合Monod方程。

（2）、分批补料培养（Fed-batch culture）分批补料培养是Yoshida等（1973）创用的，是指分批培养过程中连续地补加培养基，而不从发酵器中间断地放出培养液。

这样培养液的体积随着时间延长而增加。

分批补料培养是分批培养和连续之间的一种过渡培养方式，兼有两者的优点又可克服它们的缺点，因此在发酵工业中被广泛运用。

分批补料培养中当达到最大菌体浓度时开始补加培养基，且流加培养基速率与底物被消耗速率相等，虽然菌体总数在不断增加，而细胞浓度仍为一个常数，这种状态被称为半稳态或准稳态（Quasistady stale）。

A．当以恒速流加培养基达到准稳态时：稀释率D=F/（V0+Ft）.D随时间而下降。

μ生长比速率（h-1）μ0+Ft)补料液浓度(mol/L)S F =X/Y X/S补料速度(L/h)F=V 0μ0式中：X 为菌体浓度（g/L ），Y x/s 为基质对菌体转化率（g/mol ），一般以葡萄糖为基质酵母培养时Y X/S 约为90g/mol 。

B.上述的恒速流加在一些次级代谢产物的生产中可以用到，但在以菌体为目的的培养就不适用了。

当培养目的为获得菌体时，并要使限制性底物的浓度保持一定浓度，且菌体的比生长速率保持恒定，必须采用变速流加的方法，加料速度随时间指数增长。

理想的变速流加时体积与补料速度变化为：醪液体积V=V 0e μt补料速度F=μV 0e μt所谓Crabtree 效应即Crabtree （1929）发现，面包酵母的呼吸活力对游离的葡萄糖十分敏感，当其浓度在5μg/L 时即出现阻遏作用。

为获得最大酵母得率，不能用恒速流加的方法，而保持最大生长速率的变速流加法只是理想状态。

现今酵母的分批补料发酵的生产所采有用的方法是以自动测定发酵器的排气中的微量乙醇含量来严格控制糖补入量，这样，得到的菌体量接近理论得率。

三、实验仪器、设备和材料10升发酵罐（PH 仪，培养液及酸碱液流加装置，蠕动泵），1台；摇床，超净工作台，离心机，显微镜，分光光度计，三角瓶，面包酵母菌种，淀粉水解糖液、尿素等原料。

四、实验内容与方法：酵母菌经扩大培养后，接入10升机械搅拌通风发酵罐培养，根据实际情况选用分批培养或分批补料培养，测定酵母浓度。

主要内容有：试管斜面培养基的配制、面包酵母种子扩大培养基配制、流加用培养基的配制及灭菌。

总流程：斜面培养基配制与灭菌，接种，培养所需仪器物品：灭菌锅、试管、棉塞、培养基原料、培养箱300毫升种子液、500ml 三角瓶三只、装液100ml 、培养基、培养摇瓶、纱布。

发酵培养基制备，灭菌，接种。

离心机或板框过滤器分批培养：10升发酵培养基；灭菌；按培养条件方法接种5%培养。

面包酵母菌的培养条件及培养基组成：酵母斜面培养基：10º麦芽汁固体斜面，PH5.0酵母摇瓶培养基：10º麦芽汁，PH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.0 酵母分批发酵培养基：玉米淀粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%、玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.5。

发酵罐培养：接种量2～5%，温度25℃，搅拌200r/min，通气，1VVM（根据Y X/O计算最小需氧量及与菌体量的关系）四、实验分析项目和方法（1）酵母镜检；（2）酵母浓度测定（比浊法：湿重法）：吸取10ml菌液，2500rpm离心5min，去上清液，称量菌体湿重（3）还原糖浓度：费林法（见工业发酵分析）（4）发酵活力的测定（选做）：称取0.26g鲜酵母，加5g在30℃下恒稳lh的面粉制成面。

五、实验报告内容和数据处理实验设计原理；发酵系统的结构与操作方法，酵母浓度随时间变化的曲线图。

附：发酵系统介绍：1 技术指标1.1 概述具有温度、转速、氧气流量、空气流量、pH 、DO 、补料、消泡显示及控制功能，并配有机械消泡浆。

1.2指标1.2.1温度：自动控制范围：自来水温+5℃～ 50℃﹙±0.2 ℃﹚显示范围：0 ～150 ℃1.2.2搅拌转速：调速范围50 ～1000±5rpm1.2.3空气流量：显示控制范围0 ～ 10L/min1.2.4pH显示控制：2 ～12pH±0.05﹙酸碱双向﹚1.2.5溶解氧：0 ～150±2℅1.2.6补料、消泡蠕动泵各一台1.2.7 罐体总容积10L,设计压力2.0kg/c㎡、最高工作压力2.0kg/c㎡,设计工作温度131 ℃1.2.8 灭菌方法:手动控制蒸汽消毒灭菌1.2.9 功率：主机：3kw, 单相220v1.2.10 气源：2 ～4kg/c㎡1.2.11 蒸汽： 2 ～4kg/c㎡2 管路说明该流程图中空气管路阀门的标号为“AXX”,蒸汽管路阀门的标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”,冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。

2.1 空气及其净化来自空气压缩机的压缩空气经净化器（外接减压稳定器、除水、除尘、空气予过滤器）进入发酵罐空气总管，空气流量计针阀A01、阀A02、单向阀、空气过滤器，阀A03到达反应器内，尾气经阀VT1排出，本管路具有计量，净化作用。

注：空气流量显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。

2.2蒸汽2.2.1 蒸汽进夹套蒸汽经阀S01进入夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。

蒸汽对培养基预热。

2.2.2 蒸气进反应器蒸汽经阀S02、单向阀、空气过滤器、阀A03进入罐内，由排气口控制阀VT1排出。

蒸汽对过滤器及空气管线消毒。

2.2.3 蒸汽进取样阀及放料阀蒸汽经阀S03进入取样阀，出阀P02排出冷凝水。

2.3 自来水2.3.1 自来水进夹套当电磁阀C01打开时，自来水经自动注水阀、阀W01进入发应器夹套（下进），由夹套上口、阀W02、加热器、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电加热器、循环泵、单向阀进入夹套（下口），通过夹水套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。

特别提示：温度自动前必须对夹套注水。

2.3.2 自来水进排气冷凝器自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发2.4 冷却水（选配）（消毒后降温应优先使用自来水）冷冻水经电磁阀C02进入加热器内盘管，对夹套循环水进行冷却。

冷冻水经切换阀T02（关T01）进入自来水管线、经切换阀T04（关T03)返回冷冻水回路。

2.5 纯氧管线（选配）纯氧管线：纯氧进入流量计、电磁阀C03、切断阀A21进入空气过滤器。

纯氧流量调节：开C03、A21后调节流量计的调节手柄。

2.6 空气流量检测与控制：空气热质量流量计：与空气玻璃转子流量计并联安装且在热质量流量计前后安装切断阀。

热质量流量计内通道必须保持干燥无尘，因此只有在发酵过程中才开质量流量计的前后切断阀A11、A12，发酵结束后应及时关闭A11、A12。

（详细说明见热质量流量计的说明书）2.7 补氨水管线氨水经电磁阀C04、切断阀A31、补料针进入发酵罐，电磁阀由控制器控制。

3 实罐灭菌操作3.1 准备3.1.1 盖紧罐盖上各种罐盖，旋紧罐盖上压紧螺栓。

3.1.2 标定pH、DO电极，将电极插入罐体侧面的传感器口并及时地锁紧螺母，确保安装妥当防止高压下传感器弹出伤人。

3.1.3 关紧发酵罐底阀P01，倒入培养基，调整PH值，旋紧接种口注：氯离子对不锈钢会带来不可逆转的破坏，因此应避免用盐酸溶液调节PH，如工艺上无法避免用盐酸，应控制盐酸浓度不大于5 ℅且在添加过程中不得直接接触不锈钢。

3.1.4 关排气冷凝器进水W03，移去进出口的软管排尽冷凝水夹套中水3.1. 5 提起过滤器使过滤器后的三通阀A03处于“S”位臵。

（S—消毒，F—发酵），3.2 培养基预热3.2.1 准备工作预热启动蒸汽发生器及空气压缩机。

将控制器中的温度控制设定为手动。

开排气阀VT1，关闭其它所有阀门。

3.2.2 开排气阀VT1 ，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其它阀门3.2.3 启动反应器搅拌马达。

调转速200 ～ 300Rpm3.2.4 蒸汽进夹套：缓缓开夹套蒸汽阀S01蒸汽进夹套（注意：此时有轻微爆破声属正常，如声音过响则开阀的速度应减慢）。

待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸气排出量以有少量蒸汽排出即可。