第四章酶的提取与分离纯化

发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破 细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可 以粗略去除蛋白质以外的物质。
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使 用各种 柱层析法。
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
化学破碎法
添加有机溶剂、 添加表面活性剂
通过各种化学试剂对细胞膜 的作用，而使细胞破碎
酶促破碎法
自溶法 外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加 酶制剂的催化作用，使细胞 外层结构受到破坏，而达到 细胞破碎
酶的提取与分离纯化定义
将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再 与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过 程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、 过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电 泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
2、表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
例如，TritonX-100（特里顿）是一种非离子型清洁 剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶 解磷脂，其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层， 从而使某些胞内物质释放出来。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
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3、超声波破碎法
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100～150W；温度 0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细 胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破 碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。
干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活 性物质变性。
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
三、化学破碎法
一、机械破碎法
3、匀浆法 器械：匀浆器。 通常用于破碎那些易于 分散、比较柔软、颗粒 细小的组织细胞，细胞 破碎程度较高，其机械 切力对酶的破坏也较少， 但难于在工业生产上应 用。
二、物理破碎法
各种物理因素：温度、压力、声波等的作用， 使组织细胞破碎的方法。
多用于微生物细胞的破碎。
1、温度差破碎法
此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最 好使用对数生长期的细胞。
（3）渗透压差法
步骤：
高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
超声波破碎法特点：
处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失 少、效果好；
是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物 细胞的破碎。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常 在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却 剂进行冷却。
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4、反复冻融法
将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然 冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如 此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞 液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
化学破碎法取决于化学试剂的类型以及细 胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂对各 种微生物作用的部位和方式有所不同。
常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂
1、有机溶剂
能破坏细胞壁中的类脂。 常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透
过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞 外。
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需 反复多次。
在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、 喷雾干燥和冷冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变 细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对 干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出 来。
一、机械破碎法
通过机械运动所产生的 剪切力的作用，使细胞破 碎的方法 1、机械捣碎法： 器械：捣碎机。 常用于动物内脏、植物叶 芽等比较脆嫩的组织细胞 破碎，也可用于微生物， 特别是细菌的细胞破碎。
一、机械破碎法
2、研磨法 器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常 用于微生物和植物组织细胞的破碎。
利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使 细胞破碎。
温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎 效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度 下操作，以免酶失活。
此法难以用于工业生产。
2、压力差破碎法
高压细胞破碎机
（1）高压冲击法 （2）突然降压法
取决因素： a.压力差 b.压力减低的速度 c.细胞种类和生长期
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制 纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。
第一节 细胞破碎（Cell Disruption ）
细胞破碎：是通过各种方法使细胞外层结构破 坏的技术过程。
表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法 机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法 反复冻融法 干燥法