第四章酶的提取与分离纯化
第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
4.12第四章酶的分离纯化
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
酶的分离纯化讲解
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
酶的分离纯化
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
第四章 酶的分离
主要方法
盐溶液提取 0.02－0.5mol/L 用于提取在低浓度盐溶 液中溶解度较大的酶。 盐溶现象和盐析现象
蛋白质胶体溶液稳定的因素 ——水化膜、表面电荷 破坏胶体溶液的稳定条件，会使蛋白质能 够从溶液中沉淀出来。
水化膜
+ + + + + + +
带正电荷的蛋白质 脱水作用
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用 碱
碱 酸
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
脱水作用 酸
+ + + + + + + +
带正电荷的蛋白质
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒
酸溶液提取 pH3－6的水溶液 用于提取在稀酸溶液 中溶解度大，且稳定性较好的酶。 胰蛋白酶 0.12mol/L的硫酸溶液。 碱溶液提取 pH8－12的水溶液 用于提取在稀碱溶液 中溶解度大，且稳定性较好的酶。 细菌 L-天冬酰胺酶 pH11－12.5的碱溶 液提取。
二、酶的提取
在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原 料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称 作酶的抽提。 多数酶能溶于水，可用有机溶剂、稀酸、 稀碱、稀盐等溶剂提取。提取过程中，为 了保持酶的活性，要控制好温度、pH值等 条件。
溶剂选择原则：
一般来说 极性物质易溶解于极性溶剂中，非极性物 质易溶解于非极性溶剂中； 酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易 溶于酸性溶剂中。
视频演示
超 声 波 细 胞 破 碎 仪
化学破碎法
利用各种化学试剂破坏细胞膜的结构， 增加膜的通透性。 有机溶剂 常用的有机溶剂有：甲苯、丙酮、丁醇 等。 表面活性剂 离子型，非离子型（特里顿、吐温）
酶的提取与分离纯化课件
18
提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
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提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
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提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
酶的提取与分离纯化
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
2
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
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细菌细胞壁的结构
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酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
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(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
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二、细胞破碎（胞内酶）
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶工程 第四章酶的分离纯化 第一节细胞破碎
第一节 细胞破碎
2．表面活性剂处理 表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用， 使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。
表面活性剂有离于型和非离子型之分，对细胞破碎效 果而言，离子型表面活性剂较有效，但由于离子型表面活 性剂会使酶的结构破坏，引起酶变性失活。所以，在酶的 提取方面一般不采用离子型表面活性剂。而采用非离子型 的特里顿(Triton)、吐温(Tween)等表面活性剂。例如，用 特里顿X—100处理诺卡氏菌细胞，从而提取胆甾醇氧化 酶，用胆酸盐处理细胞，提取一种膜结合的葡聚糖酶等。 处理完后，可采用凝胶层析等方法，将表面活性剂除去， 以免影响酶的进一步分离纯化。
•
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
由于溶菌酶等上述列举的酶价格较高，而且外加酶本身混入细胞
破碎液中成为杂质，故此，外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生
产。
第一节 细胞破碎
2.自溶法
将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时 间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释 出的方法称为自溶法。
自溶法效果的好环取决于自溶条件。主要有温度、pH 值、离子强度等。自溶时间一般较长，不易控制，为防止 其他微生物在自溶液中滋长，必要时可加入甲苯、氯仿、 叠氮钠等杀菌剂。
第一节 细胞破碎
三、渗透压法
渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗 溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯水中 会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞 壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方 法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。
四、化学破碎法
化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细 胞膜的结构改变或破坏的方法。
表面活性剂处理法对膜结合酶的提取特别有效，在实 验室和生产中均已成功使用。
06 第四章 酶的分离纯化2思维导图
结晶
盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电结晶
浓缩与干燥
真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥
利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子亲和力不同而使组分分离 阳离子交换剂、阴离子交换剂、不同离子对离子交换剂的亲和力 操作过程：预处理、装柱、上柱、洗脱收集、再生 使用多孔凝胶，利用流动相中所含各种组分相对分子质量不同而使各组分分离 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 操作过程：装柱、上样、洗脱、再生 利用生物分子与配基之间所具有的可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析特性结合在一起，实现组分分离
酶按照电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此分离
等电聚焦电泳
分辨率高，区带越来越窄，样品可加在任意部位，可分离低浓度样品，可准确测定等电 点
电泳过程要求无盐溶液，在等电点时溶解度低或可能变性的组分不适用
萃取分离
有机溶剂萃取 双水相萃取
超临界萃取
反胶束萃取
利用待分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术 超临界流体密度接近液体、黏度接近气体，适于作为萃取溶剂 等温变压流程、等压变温流程、等温等压与膜分离
非膜过滤
粗滤 微滤
膜过滤
加压膜分离
电场膜分离 透析
微滤 超滤 反渗透
层析分离
吸附层析 分配层析 离子交换层析
凝胶层析 亲和层析 聚焦层析
利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法 吸附剂与洗脱剂的选择 利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离 纸层析、薄层层析
电泳分离
凝胶孔径、凝胶强度、聚合时间
常规PAGE、浓度梯度PAGE、SDS-PAGE
【全】食品酶学工程题库
第一章绪论第二章 酶的发掘与合成下列关于酶与菌株的说法正确的是？A 天然提取的酶可以满足人类现代生活需求B 霉菌、酵母菌适宜在干燥的地方生长C 富集芽孢杆菌可使用高温处理样品D 通过平板快速筛选即可以获得适合的菌株下列关于酶的发掘方法，不正确的是？A可以使用提取宏基因组的方法从不可培养微生物中寻找酶B基于功能的筛选过程中需要使菌株将酶分泌至胞外C基于序列的筛选难以筛选到序列创新性非常高的酶D从极端环境中往往可以筛到性质比较特殊的酶下列关于质粒图谱的组成说明，正确的是？A质粒中编码阻遏蛋白的序列属于其他系统原件B质粒中只能有一个复制起始位点C质粒上的筛选标记的存在，使含有质粒的宿主菌不能抵抗该种抗生素的抑制D质粒上的多克隆位点中可以含有两个以上同种酶切位点下列关于表达系统的说法，不正确的是？A大肠杆菌系统可以对表达产物进行糖基化修饰B对枯草芽孢杆菌系统中的某些内源蛋白酶进行敲除，可能产生有利于表达的效果C毕赤酵母表达系统可实现高效表达的一个原因，是其可进行高密度发酵培养D大肠杆菌表达系统的菌体发酵培养效果往往优于丝状真菌表达系统下列关于酶生物合成的调节，不正确的是？A原核生物中酶生物合成的调节主要发生在转录水平B操纵基因的作用是与阻遏蛋白相结合C酶生物合成的诱导作用机制中，只有酶催化作用的底物才有诱导作用D酶生物合成的分解代谢阻遏机制中，可以通过控制易用碳源的用量减轻阻遏第三章酶的发酵生产（1）下列关于动植物细胞产酶的调节说法错误的是？A.微生物细胞中酶合成的调节理论不适用于动植物细胞B.动植物细胞的分化会影响酶表达的时间性和空间性C.基因扩增和增强子作用都可以促进酶的生物合成D.抗体酶即有结合抗原的特性，又有酶催化的活性下列关于植物细胞培养产酶的说法哪一项是错误的？A与培养植株相比，植物细胞产酶可以明显缩短酶的生产周期B植物细胞培养产酶的技术要求低于培养植株的技术要求C植物细胞培养产酶过程易于管理，产物质量稳定D植物细胞培养条件要求高，培养周期较微生物长下列关于动物细胞培养产酶的说法错误的是？A动物细胞培养一般用于生产附加值较高的产品B动物细胞培养过程较植物细胞与微生物细胞更为困难C动物细胞培养基使用前需高温灭菌以保证无菌性D动物细胞培养过程中需维持合适的渗透压下列关于产酶微生物的保藏方法错误的是？A液氮超低温保藏法实现了低温、真空、干燥三个条件B菌体速冻保藏法不能用于菌株的长期保存C沙土管保藏法只适用于产生孢子或芽孢的微生物D在各种保藏方法中，斜面冰箱保藏法保藏过程中菌株活性最高下列关于酶生物合成的模式，不正确的是？A延续合成型最有利于酶的合成B同步合成型中酶对应的mRNA比较稳定C中期合成型中酶前期合成受到阻遏D滞后合成型中菌体停止生长后，酶还可以继续生产（2）下列关于酶的发酵培养条件说法错误的是？A碳氮比过低，往往会使体系产酸过多，影响菌体生长B偏中性的条件下有利于细菌的生长，抑制真菌的生长C某些碳源既有提供能量的作用，又有调节代谢的作用D生长因子对细胞生长繁殖非常重要，但很多情况下不需要额外添加下列关于发酵过程中的温度调控，说法错误的是？A菌体比死亡率较比生长速率对温度更为敏感B菌体在延迟期对温度变化非常敏感C将菌体在最适生长温度下培养有助于酶的发酵生产D营养物质供应不足时可以适当降低温度下列关于发酵过程pH 调控的说法正确的是？A菌体分泌的酸性或碱性物质会显著影响体系pHB菌体代谢生理酸性物质会导致体系pH 升高C发酵过程中常常使用缓冲液来维持体系pH 的稳定D菌体氮源消耗过多往往会导致体系pH 降低下列关于发酵过程中的溶氧调控，说法正确的是？A温度越高，氧传递越好B装液量越小，氧传递越好C通气量越大，氧传递越好D菌体浓度越高，氧传递越好下列关于代谢调控的说法，正确的是？A使用组成型突变株可以节省诱导剂的使用B对于诱导型产酶菌株，诱导物的添加量越多越好C组成型突变株可以解除葡萄糖效应D可以使用加入末端产物类似物的方法筛选抗分解代谢阻遏突变株第四章酶的提取与分离纯化（1）（ppt没给答案）下列哪种方法是最常用的大规模破碎细菌的方法？A匀浆法B高压均质法C有机溶剂破碎法D酶促破碎法下列哪种条件可以增强扩散作用？A降低温度B减小扩散面积C降低溶液黏度D增大扩散距离利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同特性而进行沉淀的方法属于？A盐析沉淀法B等电点沉淀法C复合沉淀法D选择性变性沉淀法下列关于离心的说法错误的是？A转子的效率因子与转子的半径和转速都有关系B对于某一离心颗粒，转子的效率因子越小，沉降时间越短C在物料离心选择离心条件时，只需考虑离心的转速和离心时间D对于某一转子，高速短时间和低速长时间可以得到相同的离心效果（2）下列说法正确的是？A粗滤过程一般使用孔径较大的膜B微滤可用于热敏性物质的过滤除菌C超滤的操作压力大于反渗透过滤D透析可应用于大规模生物分离过程下面有关层析的说法正确的是？A前缘洗脱法可以将不同组分有效分离B分配层析中，分配系数越大的组分移动越慢C阳离子交换剂基团解离后带正电D凝胶层析中分子量大的蛋白移动速度更慢下列哪一项不属于层析分离所利用的蛋白的性质？A分子的大小和形状B分子对固定相的吸附力C分子不同的催化能力D分子在不溶体系中分配系数下列关于SDS-PAGE 的说法不正确的是？A SDS 覆盖单体分子后，形成弯曲团状的SDS-亚基复合物B配制凝胶时加入的SDS 和巯基乙醇可以使蛋白解离成亚基单体C SDS-亚基复合物的表面电荷密度基本相同D电泳过程中，SDS-亚基复合物的电泳速度只跟亚基分子量大小有关在超临界萃取中，利用不同温度下溶解度不同实现萃取物质分离的过程为？A等温变压流程B等压变温流程C等温等压吸附流程D变温变压吸附流程第五章酶的性质与催化动力学下列关于影响酶促反应的因素，说法错误的是？A最适温度不是酶的特征常数B酶在不同缓冲液中同一pH 下的酶活力相同C当底物浓度大大超过酶浓度时，反应速度随着酶浓度的增加而增加D酶的激活剂能够提高酶的活力或加速酶促反应速率下列哪项不属于快速平衡学说的假设条件？A酶催化反应先生成酶底复合物，再生成产物B底物浓度远大于酶的浓度，底物浓度以初始浓度计算C不考虑酶底复合物重新解离成酶与底物这个可逆反应的存在D酶底复合物在反应开始后，与酶及底物迅速达到动态平衡下列关于米氏常数Km说法错误的是？A. Km的大小只与酶自身性质有关，酶浓度的改变不会影响其Km值B. Km值在某些情况下可以判断酶对于某一种底物的亲和力C.Km值是酶的特性，改变酶的结构也不会对其产生影响D. Km值是计算酶催化反应速率的一个重要参数下列关于竞争性抑制的说法，错误的是？A竞争性抑制剂与底物争夺酶的结合位点B可以通过提高底物的浓度来降低抑制程度C可以通过提高酶的纯度来降低抑制程度D反应动力学中的最大反应速率不变下列哪种抑制作用中，提高底物浓度对抑制程度无影响？A竞争性抑制B非竞争性抑制C反竞争性抑制D共竞争性抑制第六章酶的修饰与改造下列关于酶的结构的说法，不正确的是？A.酶原合成后，其活性并不展现B.辅酶与酶蛋白结合比较紧密，不能通过透析除去C.酶的大部分疏水链埋藏于分子内部，亲水链暴露于分子表面D.酶的活性部分具有柔性，酶的支架部分具有刚性下列关于金属离子置换修饰和大分子结合修饰的说法，不正确的是？A.金属离子置换修饰通过改变催化活性位点来影响酶的催化特性B.大分子结合修饰中大分子与酶通过共价键进行结合C.通过大分子结合修饰可以延长酶的半衰期D.通过大分子结合修饰可以降低酶在机体内的免疫反应下列关于酶的侧链基团修饰的说法，不正确的是？A.经修饰后不引起酶活力显著变化的基团为酶的非必需基团B.分子内交联修饰可以提高酶对底物的亲和力C.同型双功能试剂和异型双功能试剂都可以用于分子内交联修饰D.亲和修饰剂的结构具有与酶的底物类似的特点下列关于酶的水解修饰和置换修饰的说法，不正确的是？A.酶的肽链被水解后有可能降低酶的抗原性B.胃蛋白酶原的激活过程是典型的肽链有限水解修饰C.酶结构中单一氨基酸的变化不足以引起酶的特性发生改变D.可以通过改变酶的基因编码序列实现酶的氨基酸替换修饰下列关于酶的物理修饰及修饰酶的特性，不正确的是？A.酶的物理修饰可以改变酶的一级结构B.酶的物理修饰可以提高酶的稳定性C.通过酶的修饰可以扩大酶的最适pH 范围D.酶修饰后其米氏常数Km 值通常会变大A.酶的定向进化是指在体外进行酶基因的人工定向突变，从而得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程B.定向进化中，突变具有随机性，但可以通过特定方向的突变选择，加快酶在某一方向的进化速度C.易错PCR 技术操作较简单，所有的基因都适合使用易错PCR 技术进行定向进化改造D.采用易错PCR 时，突变频率越高，筛选到正突变的可能性越大下列关于DNA 重排和基因家族重排技术的说法正确的是？A.DNA 重排技术的酶基因进化速度较基因家族重排技术更快B.随机引物体外重组技术可以直接使用mRNA 或cDNA 为亲本进行进化C.交错延伸PCR 技术中要以一种DNA 片段为主作为母版进行PCR 扩增D.基因家族重排技术中的母版基因同源性都较低下列关于构建基因文库的说法正确的是？A.构建的文库包含DNA 片段必须尽可能完整地反应基因的结构和功能信息B.构建的文库必须有足够大的容量，保证正突变的比例更高C.构建文库的载体中可以含有重复的限制性酶切位点D.质粒载体的容量可以满足大片段基因的克隆要求下列关于基因重组的说法正确的是？A.平头末端连接的效率高于黏性末端连接的效率B.人工加尾形成的黏性末端可以方便地连接片段与再切下片段C.使用衔接物连接片段时，如果插入片段内部也有该酶位点，则不能切下完整的插入片段D.使用DNA 接头连接法连接片段，接头不会自我连接下列关于突变基因筛选的说法正确的是?A.某些情况下可以调整选择环境进行所需突变基因的定向筛选B.荧光筛选法可以实现酶定向进化过程中正突变基因的高效筛选C.透明圈平板筛选法可应用于各种突变酶的高通量筛选D.噬菌体载体携带的待筛选基因可以直接通过转化进入宿主菌中A.细胞表面展示法是使细胞将蛋白或多肽分泌至外界的一个过程B.噬菌体表面展示蛋白或多肽的筛选方法主要是特异性结合原理C.为提高筛选效率一个细胞可以同时表面展示多个蛋白D.酵母表面展示中被展示的蛋白主要与细胞的外膜蛋白结合下列关于基于酶的定点突变的酶分子理性设计说法正确的是?A.寡核苷酸介导的定位突变过程中合成的双链分子都含有突变基因B.盒式突变过程中通过合成简并寡核苷酸一次可以获得多种突变体C.PCR 介导的定位突变中所使用的引物都含有突变序列D.基于定点突变的酶分子理性设计不必分析清楚酶的构效关系下列关于酶的从头合成说法不正确的是？A.蛋白质中氨基酸的组成和顺序决定了其预期功能活性B.Rosetta设计蛋白质主要基于已有天然片段的拼接C.自然进化的随机性和长期性使人们能够获得满足需求的蛋白质D.我国研发的蛋白从头合成技术可以合成自然界不存在的新型蛋白质结构第七章酶的非水相催化下列关于酶的非水相催化说法正确的是？A.非水相体系可以提高酶的活性B.非水相体系可以改变反应的平衡方向C.可以使极性底物或产物溶解度增加D.酶的底物特异性和选择性不会改变下列关于有机溶剂对有机介质中酶催化的影响正确的是？A.天然酶分子可以溶解在有机溶剂中进行催化反应B.有机溶剂的极性越弱，对酶活力的影响越大C.有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度D.有机溶剂只能影响酶分子的表面结构酶在有机介质中哪项催化活性的改变有利于手性药物的拆分？A.底物专一性B. 立体选择性C.区域选择性D. 化学键选择性下列哪项不属于有机介质中酶催化反应的类型？A.异构化反应B.醇解反应C.水解反应D.氧化还原反应第9章酶的反应器下列关于搅拌罐反应器的说法正确的是？A.分批式反应操作精度要求高于连续式反应器B.连续式与流加式反应器可以缓解或解除底物抑制作用C.所有游离酶与固定化酶都适合用于搅拌罐式反应器D.分批式反应器的生产效率最高下列关于各类反应器的说法正确的是？A.流化床反应器的传质效果好于固定床反应器B.流化床反应器的酶装载量大于固定床反应器C.膜反应器只适用于固定化酶的反应D.喷射式反应器混合效果好、适用于各种酶的催化下列关于酶反应器的选择说法正确的是？A.游离酶可以在流化床反应器中进行反应B.填充床反应器对固定化酶的机械强度没有要求C.与分批反应器相比，使用连续反应器可以得到更高的产物浓度D.在各种反应器中，搅拌罐式反应器的应用范围最广下列关于酶反应器设计的说法正确的是？A.为了尽可能获得高的生产效率，可以不考虑反应器的生产成本B.反应过程生成的产物量即为生产过程可获得的产物量C.酶的用量可以根据反应体系中底物的量进行计算D.为了保证反应效率底物浓度越高越好。
酶工程4-1--3 酶的提取与分离提纯 酶的提取与分离提纯
用于提取在稀碱溶液中溶解度大 且稳定性较好的酶
用于提取那些与脂质结合牢固或 含有较多非极性基团的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂
主要影响因素
扩散的影响：
酶分子的扩散速度与温度、溶液黏度、扩散面积、扩散距离以及两相 界面的浓度差有密切关系。提高温度、降低溶液黏度、增加扩散面积、缩 短扩散距离, 增大浓度差等都有利于提高酶分子扩散速度, 从而增大提取效 果。 含酶原料的颗粒体积越小,则扩散面积越大,有利于提高扩散速度;适当的搅 拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面,从而增大两相界面的浓 度差,有利于提高扩散速率;适当延长提取时间,可以使更多的酶溶解出来,直 至达到平衡。
2. 酸溶液提取
3. 碱溶液提取 4. 有机溶剂提取
表4-2 酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解 度较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大, 且稳定性较好的酶
酸溶液提取
碱溶液提取
pH值为2～6的水溶液
pH值为8～12的水溶液
指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。
饱和度＝
溶液中饱和硫酸铵的体积
溶液的总体积
3) 调整盐浓度的方式
a.
饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又 不太高时。
配制饱和硫酸铵溶液
在水中加入过量的固体硫酸铵, 加热至50～60℃, 保 温数分钟 , 趁热滤去过量未溶解的硫酸铵 , 滤液在0℃ 或 25℃平衡1～2 天, 有固体析出, 此溶液即为饱和硫酸铵溶 液, 其饱和度为1。
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同, 通过添加 一定量的某种有机溶剂, 使酶或杂质沉淀析出, 从而使酶 与杂质分离 在酶液中加入某些物质, 使它与酶形成复合物而沉淀下来, 从而使酶与杂质分离
酶工程04酶的分离纯化资料
第三节
酶分离纯化的基本过程
一、酶分离纯化方法的选择
菌体内含有核酸，当菌体破裂后释放核酸，这样使菌 体抽提液粘度增加，影响菌体残渣与酶液的分离，干扰酶 蛋白的纯化，有必要除去。 除去核酸可以用核酸酶将其降解成核苷酸，使粘度下 降，便于离心分离。也可用沉淀剂使核酸中带负电荷的磷 酸基与沉淀剂中带正电荷的基团反应生成沉淀，然后离心 除去。另外还有用活性碳吸附除去核酸和核苷酸的，但是 在大量核酸存在时，用活性碳是不行的。
第四节
根据分子大小轻重建立的 分离纯化方法
根据此法建立的方法有：离心、凝胶过滤、透析和超滤等
一、透析和超滤
1.透析（dialysis):是利用蛋白不能透过半透膜而小分子的物 质如无机盐，单糖等可以透过半透膜将蛋白质与小分子杂质 分开的技术。 过程：
2.超滤
上世纪70年代以后，在实验室精制酶的过程中人们开始广 泛采用超滤技术，进行大溶质分子的浓缩、分级分离、纯 化等。其优点是操作简单、快速温和，操作中不产生相的 变化，离子状态的变化以及温度变化。 此法主要是利用压力或离心力迫使溶质按分子量、性状大 小的差异，所需溶质分子留在膜的一侧，小分子物质随溶 剂透过膜被压到另一侧，使大小溶质分子得到分开。其主 要特征是利用有选择透过的微孔膜，在液压作用下，分离 大溶质分子。
酶法；用其他纯酶将产物直接或间接转变为一个可用分 光光度法测定的化合物。例子见P64
化学法：利用化学反应使产物转变为一个可用某种物理方 法或化学方法测出的化合物，再算出酶活性。 放射性化学法：用产物或底物具有放射性的性质，通过测 定放射量的大小，算出酶活性。 （二）连续反应法 指在反应过程中用光学仪器连续检测反应进行情况，分为 非偶联的和偶联的连续反应法 酶 反应 测定方法
酶的分离纯化 ppt课件
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人：
硫酸铵盐析
免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
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在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
适用于耐热的酶，注意常要加适当的酶保护剂。 （2）加凝聚剂或絮凝剂
（3）调pH值 二、固液分离 方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取
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三、细胞破碎
捣碎法：捣碎机
机械破碎法
研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等 匀浆法：匀浆器
物理破碎法
温度差破碎法：冻融交替法 压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化
各国研究的热点。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
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一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析
2、按膜孔径或截留物质的大小：
水
超滤（UF）
（10-200nm）
纳滤（MF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm）
（＜2nm）
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各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例
微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm 纳滤
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。
为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。
在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。
二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。
此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。
如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。
其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。
酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。
因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。
酶的提取和分离纯化.pptx
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
《酶工程》课件-酶的提取与分离纯化
01
02
03
04
低温保存
将酶保存在低温条件下，如冰 箱或冰柜中，以降低酶的活性
损失。
添加稳定剂
在酶溶液中添加稳定剂，如糖 、甘油等，以增加酶的稳定性
。
真空干燥
将酶进行真空干燥处理，制成 干粉或结晶，以便长期保存。
调节pH值
通过调节酶溶液的pH值，可 以稳定酶的构象，降低酶的失
活速率。
实验操作中的安全防护措施
速率，从而计算酶活性。
荧光法
利用荧光物质作为底物，经酶 催化后产生荧光，通过测量荧 光强度变化来检测酶活性。
化学发光法
利用化学发光物质作为底物， 经酶催化后产生发光，通过测 量发光强度变化来检测酶活性 。
放射性同位素标记法
利用放射性同位素标记的底物 ，经酶催化后测量放射性强度
变化来检测酶活性。
酶的保存方法
回收率评估
计算分离纯化过程中酶的回收率，评估实验效率 和经济性。
活性评估
通过测定酶的活性，比较分离纯化前后的变化， 评估分离纯化的效果。
稳定性评估
比较分离纯化前后的酶在不同条件下的稳定性， 评估分离纯化的效果。
03
酶的活性检测与保存
酶活性检测的方法
比色法
通过酶催化特定底物反应产生 有色产物，通过比色测定反应
确保实验操作场所的清 洁和卫生，避免污染。
在操作过程中要轻柔， 避免剧烈搅拌或晃动， 以免酶失活。
注意控制实验温度和 pH值等参数，确保酶 的稳定性和活性。
在分离纯化过程中，要 密切关注实验进程，及 时处理通过电泳、质谱等技术手段检测酶的纯度，确保 达到实验要求。
佩戴防护眼镜和实验服
在进行实验操作时，务必佩戴防护眼 镜和实验服，以防止试剂溅出伤人和 避免污染衣物。
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常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂
1、有机溶剂
能破坏细胞壁中的类脂。 常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透
过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞 外。
一、机械破碎法
通过机械运动所产生的 剪切力的作用，使细胞破 碎的方法 1、机械捣碎法： 器械：捣碎机。 常用于动物内脏、植物叶 芽等比较脆嫩的组织细胞 破碎，也可用于微生物， 特别是细菌的细胞破碎。
一、机械破碎法
2、研磨法 器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常 用于微生物和植物组织细胞的破碎。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
超声波细胞粉碎机（液晶显示）
3、超声波破碎法
一、机械破碎法
3、匀浆法 器械：匀浆器。 通常用于破碎那些易于 分散、比较柔软、颗粒 细小的组织细胞，细胞 破碎程度较高，其机械 切力对酶的破坏也较少， 但难于在工业生产上应 用。
二、物理破碎法
各种物理因素：温度、压力、声波等的作用， 使组织细胞破碎的方法。
多用于微生物细胞的破碎。
1、温度差破碎法
利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使 细胞破碎。
温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎 效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度 下操作，以免酶失活。
此法难以用于工业生产。
2、压力差破碎法
高压细胞破碎机
（1）高压冲击法 （2）突然降压法
取决因素： a.压力差 b.压力减低的速度 c.细胞种类和生长期
超声波破碎法特点：
处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失 少、效果好；
是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物 细胞的破碎。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常 在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却 剂进行冷却。
4、反复冻融法
将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然 冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如 此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞 液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
酶的提取与分离纯化定义
将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再 与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过 程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、 过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电 泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活 性物质变性。
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
三、化学破碎法
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破 细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可 以粗略去除蛋白质以外的物质。
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使 用各种 柱层析法。
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需 反复多次。
在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、 喷雾干燥和冷冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变 细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对 干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出 来。
此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最 好使用对数生长期的细胞。
（3）渗透压差法
步骤：
高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100～150W；温度 0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细 胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破 碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制 纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。
第一节 细胞破碎（Cell Disruption ）
细胞破碎：是通过各种方法使细胞外层结构破 坏的技术过程。
表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法 机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法 反复冻融法某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
例如，TritonX-100（特里顿）是一种非离子型清洁 剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶 解磷脂，其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层， 从而使某些胞内物质释放出来。
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
化学破碎法
添加有机溶剂、 添加表面活性剂
通过各种化学试剂对细胞膜 的作用，而使细胞破碎
酶促破碎法
自溶法 外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加 酶制剂的催化作用，使细胞 外层结构受到破坏，而达到 细胞破碎