水稻突变体介绍及鉴定(很详细)汇总教材
水稻突变体介绍及鉴定（很详细）汇总教材
水稻突变体介绍及鉴定（很详细）汇总教材RMD水稻突变体信息及基因型鉴定1.背景介绍：突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。
植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。
为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。
2.原理：2.1农杆菌介导的T-DNA 插入农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。
1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。
Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。
研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。
T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。
我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。
大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。
由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA 类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。
我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。
一个水稻黄绿叶突变体的鉴定与基因克隆中期报告
一个水稻黄绿叶突变体的鉴定与基因克隆中期报告一、研究背景水稻作为全球最重要的粮食作物之一，在全球范围内受到广泛关注。
然而，水稻生长过程中常常会出现各种突变现象，比如叶片颜色变异、形态变异等。
这些变异现象虽然是一种自然现象，但是对水稻的生长和产量可能会产生不良影响。
因此，研究水稻突变现象的成因和机制，对于提高水稻品质和产量具有十分重要的意义。
本研究的要点是鉴定和克隆水稻黄绿叶突变体的基因，揭示其形成机制和生物学意义，从而为水稻品种改良提供一定的理论基础。
二、研究内容1.鉴定黄绿叶突变体本研究采用了遗传学和生物化学等多种手段，对水稻黄绿叶突变体进行了全面鉴定。
首先对黄绿叶突变体进行了遗传连锁分析，并利用构建的遗传图谱对该突变体的遗传背景进行了分析。
接着，利用叶绿素荧光分析和叶片组织解剖等手段，对黄绿叶突变体的叶绿素合成和组织结构进行了详细的研究。
2.克隆黄绿叶突变体的基因针对黄绿叶突变体的遗传分析结果，本研究团队使用了高通量测序技术，对黄绿叶突变体所在的基因进行了全长克隆。
接着，采用RT-qPCR技术对该基因在不同发育时期的表达模式进行了分析，以揭示该基因在水稻生长发育过程中的功能。
三、预期成果1.鉴定和命名一种新的水稻黄绿叶突变体；2.克隆该突变体相关的基因；3.揭示该基因在水稻生长发育过程中的功能和作用机制。
四、研究意义本研究的主要意义在于：1.为了解水稻突变现象的成因和机制，提高水稻品质和产量，提供了一定的理论基础和技术支持；2.对于探索生物多样性和遗传变异的机制，具有重要意义；3.对于我们对水稻基因组的认识和理解，将有所促进。
水稻类病斑突变体wy3的鉴定和基因定位
水稻类病斑突变体w y３的鉴定和基因定位张宏根＃㊀王茂宇＃㊀张丽佳㊀胡雅㊀马佳琦㊀张翼帆㊀汤述翥∗㊀梁国华㊀顾铭洪(扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室/教育部植物功能基因组学重点实验室,江苏扬州２２５００９;＃共同第一作者;∗通讯联系人,E Ｇm a i l :s z t a n g＠y z u ．e d u ．c n )C h a r a c t e r i z a t i o na n dG e n eM a p p i n g o fL e s i o n M i m i cM u t a n t w y３i nR i c e Z H A N G H o n g ＧG e n ＃,W A N G M a o Ｇy u ＃,Z H A N G L i Ｇj i a ,H U Y a ,M A J i a Ｇqi ,Z H A N G Y i Ｇf a n ,T A N G S h u Ｇz h u ∗,L I A N G G u o Ｇh u a ,G U M i n g Ｇh o n g(K e y L a b o r a t o r y o f C r o p G e n e t i c s a n dP h y s i o l o g y o f J i a n g s uP r o v i n c e /K e y L a b o r a t o r y o f P l a n t F u n c t i o n a l G e n o m i c s ,M i n i s t r y o fE d u c a t i o n ,Y a n g z h o u U n i v e r s i t y ,Y a n g z h o u ２２５００９,C h i n a ;＃T h e s ea u t h o r sc o n t r i b u t e d e q u a l l y tot h i s w o r k ;∗C o r r e s p o n d i n ga u t h o r ,E Ｇm a i l :s z t a n g ＠yz u ．e d u ．c n )Z HA N G H o n g g e n ,WA N G M a o y u ,Z HA N G L i j i a ,e t a l ．C h a r a c t e r i z a t i o na n d g e n e m a p p i n g of l e s i o n m i m i cm u t a n t w y３i n r i c e ．C h i n JR i c eS c i ,２０１６,３０(３):２３９Ｇ２４６．A b s t r a c t :Al e s i o n m i m i c m u t a n t w y ３w a so b t a i n e df r o mt h e p r o g e n y o fa j a po n i c a v a r i e t y W u y u j i n g ３b y n a t u r a l m u t a t i o n ．T h e l e s i o n sw e r e f i r s t o b s e r v e do n t h e l e a v e s a t t h e s e e d l i n g s t a g e ,t h e n s p r e a d g r a d u a l l yt o t h ew h o l e l e a f a t t h e i n i t i a l t i l l e r i n g s t a g e ．C o m p a r e dw i t h t h ew i l d t y p e (WT ),t h e p l a n th e i g h t ,t h en u m b e r o f e f f e c t i v e t i l l e r ,pa n i c l e l e n g t h ,g r a i nn u mb e r p e r p a n ic l ea n ds e e ds e t t i n g r a t eo f w y３w e r e r e d u c e ds i g n i f i c a n t l y ．T h es h a d i n g a s s a y s h o w e d t h a t t h e l e s i o n so nl e a v e so f w y３w e r e i n d u c e db y n a t u r a l l i g h t ．C o m p a r e d w i t ht h e w i l dt y p e ,t h e p h o t o s y n t h e t i c p i g m e n t a n d t h en e t p h o t o s y n t h e t i c r a t e o f w y３w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d ,b u t t h eS O Da c t i v i t y ,P O Da c t i v i t y ,C A T a c t i v i t y a n dM D Ac o n t e n t o f w y ３w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o fWT．T r y p a n b l u e s t a i n i n g e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h e r ew e r e a l a r g e n u m b e r o f d e a d c e l l s i n t h em u t a n t l e s i o n ．G e n e t i c a n a l y s i s s u g g e s t e d t h a t t h e p h e n o t y p e o f w y３w a s c o n t r o l l e db y a s i n g l e r e c e s s i v e n u c l e a r l o c u s ,a n d t h e t a r g e t g e n ew a sm a p pe db e t w e e nm a r k e r sW ２Ｇ１７a n dW ２Ｇ１８w i t h t h e p h y s i c a l d i s t a n c e of ２８k bo n c h r o m o s o m e ２．S e q u e n c ea n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h em u t a t e dg e n e i n w y３h a da s i n g l en u c l e o t i d e d e l e t i o na t t h e ３７５t h i nC D So f L O C _O s ０２g ０２０００,r e s u l t i n gi n a p r e m a t u r e t e r m i n a t i o n o f t r a n s l a t i o n o f t h e t a r ge t g e n e ,w h i c h i s a nn e wa l l e l e of O s HP L ３．K e y w o r d s :r i c e ;l e s i o nm i m i cm u t a n t ;g e n em a p p i n g 张宏根,王茂宇,张丽佳,等．水稻类病斑突变体w y３的鉴定和基因定位．中国水稻科学,２０１６,３０(３):２３９Ｇ２４６．摘㊀要:在粳稻品种武育粳３号栽培群体中获得一个类病斑突变体w y ３.该突变体类病斑出现于苗期,分蘖期扩散至整张叶片,属于扩散型类病斑突变体.相比野生型,突变体w y ３的株高明显降低,有效分蘖数减少,穗长㊁每穗粒数㊁结实率均显著降低.遮光处理表明,突变体w y ３类病斑的产生受自然光诱导.台盼蓝染色结果表明,类病斑部位有大量的死亡细胞.突变体w y３的光合色素含量和净光合速率较野生型显著降低,S O D ㊁P O D ㊁C A T 活性和M D A 含量均显著高于野生型.遗传分析表明突变体表型受单隐性核基因控制,采用B S A 将该基因初步定位在第２染色体短臂端粒附近.采用F ２群体中１０９９株类病斑单株将基因定位在标记W ２Ｇ１７和W ２Ｇ１８之间２８k b 的物理距离内.测序结果表明,突变体w y３中的L O C _O s ０２g０２０００编码区(C D S )第３７５位碱基C 缺失,导致翻译提前终止,突变体中该候选基因为O s H P L ３的一个新等位基因.关键词:水稻;类病斑突变体;基因定位中图分类号:Q ３４３ ５;Q ７５４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀文章编号:１００１Ｇ７２１６(２０１６)０３Ｇ０２３９Ｇ０８㊀㊀植物斑点叶(s po t t e d l e a f )突变体是指植物在没有遭受病原物侵染或明显逆境条件下在叶片或叶鞘上自发形成斑点的一类突变体,由于这些斑点与病原物侵染后产生的病斑非常相似,又被称为类病变突变体(l e s i o ns i m u l a t i n g di s e a s e m u t a n t ,l s d )或类病斑突变体(l e s i o n m i m i cm u t a n t ,l m m )[１].类病斑突变体广泛存在于水稻㊁拟南芥㊁玉米㊁大麦和大豆等植物中[２Ｇ７].根据突变体的表型,类病斑突收稿日期:２０１５Ｇ１１Ｇ３０;修改稿收到日期:２０１５Ｇ１２Ｇ２４.基金项目:国家自然科学基金资助项目(３１０７１３８４,３１０００５３３);江苏省科技支撑计划资助项目(B E ２０１３３０１);江苏高校优势学科建设工程资助项目.９３２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i ),２０１６,３０(３):２３９－２４６h t t p ://w w w．r i c e s c i ．c n D O I :１０．１６８１９/j．１００１Ｇ７２１６．２０１６．５１７６变体可分为起始型和扩散型[８Ｇ１０],起始型突变体的病斑有相对稳定的分布位置和大小,而扩散型突变体的病斑形成以后会很快扩散到叶片的其他部位,甚至包括叶鞘和茎秆.已有研究表明,植物类病斑的发生主要与过敏性反应(h y p e r s e n s i t i v er eＧs p o n s e,H R)导致的细胞程序性死亡以及细胞死亡途径中自由基非正常产生有关[１１Ｇ１３].此外,许多类病斑突变体对某些植物病原物表现出了一定的抗性[１４Ｇ１６],能激发病程相关蛋白的表达[１７Ｇ１８],可以提高植株的持久㊁广谱抗病性.因此,这类突变体对植物过敏反应激活机制和植物抗病反应机制的研究具有重要意义.目前,水稻中已经发现了８０多个类病斑突变[１９].其中,绝大部分呈单隐性核基因遗传规律,也有部分表现为双隐性核基因或显性核基因遗传规律.在这些类病斑基因中,s p l５[２０]㊁s p l７[２１]㊁s p l１１[２２]㊁s p l１８[２３]㊁s p l２８[１６]㊁T t m l[２４]等１８个基因已被克隆,这些基因编码许多不同类型的蛋白,如第一个被克隆的水稻类病变突变基因s p l７编码一个热激转录因子蛋白(h e a t s t r e s s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r p r o t e i n,H S F)[２１],s p l１１编码一个UＧb o x/A r m aＧd i l l o重复蛋白[２２],s p l１８编码一个酰基转移酶[２３].类病斑基因的克隆与功能研究表明类病变过程非常复杂,这些基因的作用机制以及性状表现各不相同,涉及到许多生化代谢过程,但突变体性状大多与细胞程序性死亡相关[２２].本课题组在粳稻品种武育粳３号栽培群体中获得一个稳定遗传的类病斑突变体w y３,该类病斑突变是自然诱变产生.本研究中以w y３为材料,描述了该突变体的形态特征㊁生理学特性,并对该突变基因进行了精细定位与克隆,以期为该基因的功能研究及应用提供理论依据.１㊀材料与方法１．１㊀实验材料２０１３年扬州正季,在粳稻品种武育粳３号栽培群体中获得一个类病斑突变体w y３,经过多代连续种植,突变体类病斑表型稳定遗传.２０１４年正季扬州,以籼稻品种K a s a l a t h为父本与w y３杂交获得F１,２０１４年冬季在海南种植F１及相关亲本,成熟期收获F１植株自交种子.２０１５年正季,种植突变体w y３㊁野生型武育粳３号及组合w y３/K a s a l a t hF２群体.１．２㊀表型鉴定２０１５年正季,将突变体w y３和对照武育粳３号种植于扬州大学农学院实验基地,小区种植,３次重复,管理与一般大田相同.全生育期观察田间突变体的表型,包括突变体斑点出现的时期㊁颜色及分布情况等.成熟后随机从小区中央选取１０株考查株高㊁单株穗重㊁每株有效穗数㊁每穗粒数㊁每穗实粒数㊁结实率和千粒重等性状.１．３㊀光照处理实验通过遮光试验了解光照对斑点发生的影响.大田条件下,在苗期用宽度约为１c m的锡箔纸对突变体w y３叶片已有斑点和无斑点部位进行遮光处理,各重复３次.分别观察遮光１５d及恢复光照７d后斑点的发生及变化情况,并拍照.１．４㊀突变体死亡细胞鉴定苗期,分别取野生型正常叶片与突变体w y３发生类病斑的叶片,剪成１c mˑ１c m大小.加入台盼蓝染液(染液配方参照Y i n等[２５]的方法),真空抽滤使染液进入细胞间隙,沸水蒸沸５~８m i n.室温下静置６~８h后用２．５g/m L的水合氯醛溶液脱色,直到组织完全透明为止.脱色好的叶片在体视显微镜下观察㊁拍照.１．５㊀叶绿素含量测定分蘖期,分别取野生型正常叶片与突变体w y３发生类病斑的叶片,按L i c h t e n t h a l e r等[２６]修正的A r n o n法进行叶绿素和类胡萝卜素含量测定,具体操作如下:将鲜叶去掉叶脉,截取叶片中段(叶片最宽处),擦净组织表面污物,并吸干叶片表面附着水;准确剪成２mm条状并称取０．２g鲜样３份,分别置于３个２０m L带盖的玻璃管中;吸取１０m L提取液(９６％乙醇)置于玻璃管中,密封并置于３０ħ~５０ħ水浴锅中萃取３h,此过程中需轻摇几次.当叶片完全变白时即可比色.比色时,以提取液为空白,在波长６６３n m㊁６４６n m和４７０n m下测定吸光度.每样重复测定２次.１．６㊀光合作用相关指标的鉴定始穗期,使用L iＧ６４００型便携式光合测定仪于晴天上午９:００－１１:００分别测定w y３及其野生型剑叶叶片的净光合速率(n e t p h o t o s y n t h e t i c,P n)㊁气孔导度(l e a f c o n d u c t a n c e,G s)㊁蒸腾速率(t r a nＧs p i r a t i o nr a t e,T r)和胞间C O２浓度(i n t e r c e l l u l a r C O２c o n c e n t r a t i o n,C i),各测定３片具有代表性的剑叶.光合测定仪使用红蓝光源,光强恒定为１２０００４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第３０卷第３期(２０１６年５月)μm o l/(m２ s),温度为３０ħ,C O２浓度为空气中的浓度,湿度为大气中的湿度.取３次重复的平均值进行分析.１．７㊀抗氧化酶活性测定分蘖期,测定突变体w y３和对照相同部位叶片中超氧化物歧化酶(s u p e r o x i d ed i s m u t a s e,S O D)㊁过氧化物酶(p e r o x i d a s e,P O D)㊁过氧化氢酶(c a t aＧl a s e,C A T)活性和丙二醛(m a l o n a l d e h y d e,M D A)的含量.所有测定重复３次,取平均值进行分析. S O D活性采用S O D测试盒(南京建成生物工程研究所生产)测定,该试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法; P O D活性采用愈创木酚法[２７]测定,以每１m i n内O D４７０变化０．０１为一个过氧化物酶活性单位(U);C A T活性采用高锰酸钾滴定法测定;MD A含量采用硫代巴比妥酸(t h i o b a r b i t u r i ca c i d,T B A)法测定.１．８㊀图谱构建与数据分析采用隐性分离群体进行遗传分析和基因定位.在F２群体中,根据分子标记检测的结果,具有w y３突变亲本带型的个体赋值１,具有K a s a l a t h带型的个体赋值３,具有双亲带型(杂合带)的个体赋值２,利用M a p M a k e r３．０作图软件进行基因位点与标记间连锁分析,用K o s a m b i函数将重组率转化为遗传距离(c e n t i M o r g a n,c M).其他数据在E x c e l２０１３中处理.１．９㊀候选基因分析根据基因精细定位结果,查阅在水稻基因组注释数据库(R i c eG e n o m eA n n o t a t i o nP r o j e c t)中相应区间内的所有开放阅读框(O R F),并分析可能的候选基因.根据候选基因全长基因组D N A序列,设计测序引物,分别对野生型和突变体的基因组进行扩增并测序.测序结果用C o n t i g E x p r e s s软件拼接完整再通过D N A S T A R软件进行比对,确定突变位点.２㊀结果与分析２．１㊀突变体表型鉴定在大田自然条件下,突变体w y３从苗期开始叶片表面出现类病斑,分蘖期比较明显.叶片上斑点出现的位置并无特殊规律,但最终都会扩散到整张叶片,表现为扩散型突变体.考查突变体与野生型的农艺性状,突变体的长势较差,株高㊁穗长㊁每穗粒数㊁结实率等农艺性状也显著低于对照(表１,图１).造成突变体株高等性状显著降低的原因可能是由于突变叶片过早枯死,光合作用能力减退.２．２㊀光照对突变体的影响对突变体w y３只出现少量类病斑的叶片未产生类病斑部位用锡箔纸遮光１５d后发现,整张叶片A－苗期植株表型;B－分蘖初期野生型(左)和突变体w y３(右)植株表型;C－成熟期野生型(左)和突变体w y３(右)植株表型;D－野生型(左)和突变体w y３(右)穗部表型;E－分蘖期野生型(左)和突变体w y３(右)叶片表型.A,P h e n o t y p e s o f w y３d u r i n g s e e d l i n g s t a g e;B,P h e n o t y p e s o fWT(l e f t)a n d w y３(r i g h t)d u r i n g t h e e a r l y t i l l e r i n g s t a g e;C,P h e n o t y p e s o f WT(l e f t)a n d w y３(r i g h t)d u r i n g t h em a t u r e s t a g e;D,P a n i c l e t r a i t s o fWT(l e f t)a n d w y３(r i g h t);E,L e a v e s o fWT(l e f t)a n d w y３(r i g h t) d u r i n g t h e e a r l y t i l l e r i n g s t a g e．图１㊀突变体w y３及其野生型表型F i g．１．P h e n o t y p e s o f w y３a n dw i l d t y p e(W T)．１４２张宏根等:水稻类病斑突变体w y３的鉴定和基因定位表１㊀突变体和野生型的农艺与产量性状T a b l e １．P e r f o r m a n c e o f a g r o n o m i c a n d y i e l d t r a i t s o f t h em u t a n t w y ３a n d t h ew i l d t y pe (W T )．材料M a t e r i a l株高P l a n t h e i g h t /c m分蘖数N o ．o ft i l l e r s 穗长P a n i c l e l e n g t h /c m结实率S e e d Ｇs e t t i n g r a t e/％每穗粒数G r a i nn u m b e r pe r p a n i c l e 粒长G r a i n l e n g t h /mm粒宽G r a i nw i d t h /mm千粒重１０００Ｇg r a i n w e i g h t /gw y３５６．９ʃ０．６∗∗３．５ʃ０．６∗∗１４．８ʃ１．２∗∗７９．０ʃ０．１∗∗８９．６ʃ６．８∗∗７．５ʃ２．２３．４ʃ１．４２６．５４ʃ０．５６WT８７．５ʃ０．５１０．０ʃ１．７１６．６ʃ０．８９８．３ʃ０．１１２３．６ʃ１１．０７．３ʃ２．８３．３ʃ０．９２６．８５ʃ０．６２㊀㊀∗∗表示在０．０１水平差异显著.下同.∗∗d e n o t e s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e a t ０．０１l e v e l ．T h e s a m e a s b e l o w．表２㊀突变体w y３和野生型叶片光合色素含量T a b l e ２．P i g m e n t c o n t e n t s i n l e a v e s o f w y ３a n dw i l d t y pe (W T )．材料M a t e r i a l叶绿素a 含量C h l o r o p h yl l a c o n t e n t /(m gg －１)叶绿素b 含量C h l o r o p h yl l b c o n t e n t /(m gg －１)叶绿素a /bC h l o r o p h y l l a /b 类胡萝卜素含量C a r o t e n o i d c o n t e n t /(m gg －１)w y３１．２８ʃ０．０９∗∗０．２７ʃ０．１１∗∗４．６８ʃ０．１３∗∗０．１５ʃ０．１１∗∗WT２．２８ʃ０．０３０．９９ʃ０．０８２．３１ʃ０．０７０．５９ʃ０．０４A－遮光前w y ３;B －未发生斑点部位遮光１５d 后;C －遮光部位恢复光照７d 后;D －野生型.A ,L e a f o f w y ３b e f o r e s h a d i n g ;B ,L e a fw i t h o u t l e s i o n a f t e r s h a d i n g f o r １５d a y s ;C ,L e a f s h a d e d f o r ７d a y s t h e nu n d e r n o r m a l l i g h t f o r ７d a y s ;D ,W i l d t y pe ．图２㊀遮光对突变体w y３叶片的影响F i g ．２．E f f e c t s o f s h a d i n g on w y ３l e a v e s ．其他部位都产生类病斑,但是遮光部位没有产生类病斑;恢复光照,跟踪观察原遮光部位变化,一周后,原本没有类病斑的遮光处产生了明显的类病斑(图２).该结果表明,类病斑的发生受自然光照的诱导,适当的遮光可以阻止或者减轻类病斑的发生或者扩散.２．３㊀叶绿素含量变化分蘖期,通过对突变体和野生型叶片叶绿素含量的测定结果可以看出,突变体的叶绿素a ㊁叶绿素b 和类胡萝卜素含量均显著低于野生型,但叶绿素a /b 比值显著高于其野生型,说明突变体w y ３是一个叶绿素缺陷突变体(表２).２．４㊀突变对光合作用的影响始穗期,测定突变体w y ３和野生型剑叶的光合参数,包括净光合速率(P n )㊁气孔导度(G s )㊁蒸腾速率(T r )和胞间C O ２浓度(C i ).由于在该时期突变体叶片类病斑明显,突变体w y３所测得的P n ㊁G s ㊁T r 和C i ４个参数均显著低于野生型(表３),说明类病斑的发生导致突变体光合能力的降低.２．５㊀突变体叶片细胞死亡鉴定利用台盼蓝染色方法对突变体及野生型叶片中死亡细胞进行检测.经台盼蓝染色后,野生型叶片整体呈淡蓝色,没有深蓝色染色,说明野生型叶片基本上没有细胞死亡.与野生型叶片不同的是,突变体类病斑发生处对应着严重的深蓝色小点,说明斑点部位有大量的死亡细胞,而在大块深蓝色染色间隙也出现了深蓝色的小点,说明类病斑正在扩散中(图３).２．６㊀抗氧化酶活性的变化㊀㊀植物细胞程序性死亡时常产生活性氧的沉积,２４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i )㊀第３０卷第３期(２０１６年５月)表３㊀突变体w y３和野生型武育粳３号分蘖期叶片光合特性T a b l e ３．P h o t o s y n t h e t i c p a r a m e t e r s o f w y ３a n dw i l d t y p e (W T )a t t h e i n i t i a l t i l l e r i n g s t a ge ．材料M a t e r i a l净光合速率P n /(m m o lm －２s －１)蒸腾速率T r /(mm o lm －２s －１)气孔导度G s/(m o lm －２s －１)胞间C O ２浓度C i/(m m o l m o l－１)w y３１４．１６ʃ０．２７∗∗１９３．２７ʃ１０．１０∗∗０．１３ʃ０．０２∗∗２．７６ʃ０．２３∗∗WT２２．４６ʃ０．２９２７６．９６ʃ６．３００．６６ʃ０．０８８．９３ʃ０．４３图３㊀武育粳３号和w y３叶片的台盼蓝染色检测F i g ．３．T r y p a nb l u e s t a i n i n g o f l e a v e s o f t h em u t a n t w y ３a n dw i l d t y pe (W T )．因此测定了突变体w y３和野生型相同部位叶片中一系列的活性氧代谢生理指标.结果显示,突变体w y３中C A T ㊁P O D ㊁T ＧS O D 以及M D A 含量均显著高于野生型(图４),说明在突变体叶片产生类病斑后,活性氧大量积累,活性氧的积累诱发了植物细胞合成大量的超氧化物歧化酶,超氧化物歧化酶将自由基状态的氧负离子以及单线态氧歧化为过氧化氢,过氧化氢在细胞中的积累诱发过氧化物酶(过氧化氢酶)的大量表达.同时,在突变的叶片中活性氧大量积累导致叶片细胞中的生物膜的磷脂分子的不饱和脂肪酸链大量过氧化,生成大量丙二醛.２．７㊀w y３的遗传控制与基因定位２０１４年海南,K a s a l a t h 与突变体w y３配置的F １植株叶片表型正常,２０１５年F ２群体中出现明显的分离,分别表现双亲性状,其中正常株３０００株,类病斑单株１０９９株.经卡方测验,正常株与突变株符合３ʒ１分离比(c ２＝０．７２９５＜c ２０．０５,１＝３．８４).表明突变体w y３类病斑性状受一对隐性核基因控制.为定位该类病斑基因,在均匀分布于水稻１２条染色体的３８０对S S R 标记中,筛选出１２０对在K a s a l a t h 双亲间显示多态性的标记.分别取１５株正常株和１５株突变株构建正常基因池和突变基因池,利用上述多态标记对这两个基因池进行检测.在所用检测的１２０对标记中,第２染色体的标记R M ３３４０和R M １２３６８在两个混池间表现出差异,初步推测这两个标记与基因连锁.进一步选取３０株正常株和３０株类病斑植株,利用R M３３４０㊁∗∗P ＜０．０１．图４㊀突变体w y３与野生型(W T )对照在分蘖期的生理学特性比较F i g ．４．P h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h ew i l d t y p e (W T )a n d t h e w y ３m u t a n t d u r i n g t h e t i l l e r i n g s t a ge ．３４２张宏根等:水稻类病斑突变体w y ３的鉴定和基因定位表４㊀本研究开发的多态性S T S 标记T a b l e ４．P o l y m o r p h i c S T Sm a r k e r s d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y．标记M a r k e r反向引物F o r w a r d p r i m e r (５ᶄＧ３ᶄ)正向引物R e v e r s e p r i m e r (５ᶄＧ３ᶄ)W ２Ｇ１０G A G A T G C C A G G A G A A T G A T G T A G C T G A G G G T T T G A T A W ２Ｇ１７A A A T C T G G A C C T G A A A G TT T A G G G A A G A T T C T C A A A W ２Ｇ１８G C C A G C G A G A A G A A G A A G G A G G A T G T G G T C G G G T G TW ２Ｇ３G C A G C A C G G A C T A C A A G A C A A T T C T G C C A T G A C C A A W ２Ｇ１３T A G T G T C G C C C C T T T T A A C A T C A C A G C A A A C A A G CAA－基因的初步定位;B－基因的精细定位;C－覆盖基因物理图谱;D －基因内变异位点.A ,P r i m a r i l y m a p p i n g o ft a r g e t g e n e ;B ,F i n e m a p p i n g o ft a r g e t g e n e ;C ,P h y s i c a lm a p o f g e n e s ;D ,T h e m u t a t i o nl o c u so f t a r g e t ge n e ．图５㊀水稻类病斑突变体基因定位F i g ．５．M a p p i n g o f t h e t a r g e t ge n e i n w y ３．R M １２３６８进行检测,正常株表现为K a s a l a t h 或F １条带,类病斑植株表现为突变体w y ３条带,说明标记R M ３３４０㊁R M １２３６８与基因连锁(图５).结合本实验室已有的S S R 标记和G r a m e n e (h t t p://w w w．g r a m e n e ．o r g )网站上提供的S S R 信息,在标记R M ３３４０㊁R M １２３６８附近筛选了１４对S S R 标记,其中R M １２３１７㊁R M １２３３９和R M １２３４８在双亲之间具有多态.利用这些标记对F ２群体中１０９９株类病斑单株进行检测,结果在标记R M ３３４０处找到２８个交换株,在标记R M １２３３９处找到５３对交换株,根据交换株信息,初步将基因定位在R M ３３４０和R M １２３３９之间.为了进一步精细定位基因,结合已经公布的水稻品种９３１１和日本晴全基因组序列,利用P r i m e rP r e m i e r ５．０软件,在水稻第２染色体上发展了１３对新的S T S 标记,其中５对标记表现出多态性(部分引物序列如表４所示).利用５对多态标记和８１株交换株,最终把基因定位在W ２Ｇ１７和W ２Ｇ１８之间,两标记间物理距离约为２８k b .２．８㊀候选基因测序分析根据水稻基因组注释数据库(R i c e G e n o m e A n n o t a t i o nP r o j e c t )中的数据,在定位区间共有６个开放阅读框(L O C _O s ０２g ０１９６０－L O C _O s ０２g ０２０１０).对这６个O R F 进行基因组测序.结果发现,与野生型武育粳３号相比,突变体w y ３中的L O C _O s ０２g ０２０００编码区(C D S )第３７５位碱基C 缺失,编码序列在９２０b p 处出现终止子TG A ,使得翻译提前终止(图５),并且野生型武育粳３和日本晴在这个O R F 上的序列完全相同.３㊀讨论在植物中已经发现的大量斑点叶或类病斑突变体中,斑点或者类病斑的出现往往伴随着其他农艺性状的改变,但不同突变体表现并不一致.例如h m １９７[１９]㊁l m s １[２８]㊁l m m ４[２９]等植株株高降低,而突变体s p l ３２[３０]株高未有显著变化;在分蘖数上,h m １９７[２８]㊁g ３４０[３１]㊁s pl ３２[３０]等均未发生显著变化;在结实率上,l m m ４[２９]㊁s p l ３１[３２]㊁s p l ３２[３０]等突变体均显著下降,但g ３４０[３１]突变体结实率没有显著变化.本研究中,w y ３株高㊁分蘖数㊁结实率均显著低于其野生型,植株光合作用能力的下降是造成这些农艺㊁产量性状降低的主要原因.类病斑突变体叶绿素各组分含量显著低于野生型,叶绿素含量降低这一结果也与突变体植株叶片表型相符合,这也导致突变体中叶片光合作用能力的下降.已有研究发现,类病斑形成部位通常伴随自由基和活性氧的积累.在植物细胞中,无法及时清除的活性氧积累是诱导细胞进行程序性死亡的重要信４４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i )㊀第３０卷第３期(２０１６年５月)号因子.S a m u i l o v等[３３]研究表明活性氧的积累与植物细胞凋亡的起始与调节有重要关系.在水稻中已经被克隆的类病斑突变体基因中,O s L S D１[３４]㊁s p l１１[２２]㊁s p l２８[１６]等突变体基因与细胞的凋亡有关.本研究中,台盼蓝染色后发现类病斑叶片出现大量死亡细胞,进一步测得突变体w y３类病斑叶片中的S O D㊁P O D㊁C A T和M D A均极显著高于对照叶片,这一结果说明在突变体w y３叶片产生类病斑后,叶片细胞中存在大量的活性氧自由基,进而调控细胞非程序性死亡,造成了突变体叶片最终枯死.㊀㊀本研究中,利用组合K a s a l a t h/w y３衍生F２群体中的１０９９株隐性单株,将突变体中控制类病斑基因定位在第２染色体短臂标记W２Ｇ１７和W２Ｇ１８之间２８k b的物理区间内.根据已有的报道,在此区间内已经报到了３个类病斑基因s p l２[３５],c e a６２[３６]和O s HP L３[３７],其中s p l２未进行精细定位,c e a６２与O s HP L３已克隆.通过对定位区间内候选O R F 进行测序发现,与野生型相比,突变体w y３中的L O C_O s０２g０２０００编码区(C D S)第３７５位碱基C缺失,编码序列在９２０b p处出现终止子T G A,使得翻译提前终止.不同的是,突变体c e a６２是在L O C_ O s０２g０２０００编码区第１１４６b p处发生单碱基替换(T A CңT A G)从而使得翻译过程提前终止,O s HＧP L３突变体中的L O C_O s０２g０２０００编码区５１８b p 和５１９b p之间插入了一个大约７００b p大小的转座子,使得该基因功能丧失,从而发生类病斑突变.由此可以看出,本研究中定位到的类病斑基因和c e a６２㊁O s HP L３为变异位点不同的复等位基因.尽管s p l２没有被精细定位,但比较已有的定位结果及突变体表型,可以推断c e a６２㊁O s HP L３及本研究中克隆的基因与已报到的s p l２均为等位基因.从表型来看,突变体w y３与已报道的c e a６２和O s HP L３基本一致,但也有所差异.突变体w y３在发生突变时期㊁病斑扩散形式㊁病斑颜色以及植株株高和分蘖等性状上都与c e a６２㊁O s HP L３表现一致,但是w y３在千粒重上与野生型并没有发生显著变化,这与O s HP L３的千粒重较野生型显著下降有所不同[３６];突变体w y３在结实率上的表现与c e a６２有所不同,c e a６２结实率极显著低于野生型,这种极显著降低是由于花粉育性降低造成的[３７],而本研究中w y３花粉育性与野生型并无显著差异(数据未列出),突变体w y３结实率下降是由于植株后期叶片枯死,籽粒灌浆不充实而出现大量瘪粒造成的.另外,O s HP L３突变体来源于粳稻品种中花１１,c e a６２背景源于日本晴,结合性状上的差异,我们推测差异的原因可能是突变位点的不同或核背景不同.鉴于此,我们将该突变基因导入日本晴背景,以期在不同背景下研究该基因的差异.由于实验进度限制,结果仍在进一步研究中.参考文献:[１]㊀王忠华．植物类病变突变体的诱发与突变机制．细胞生物学杂志,２００６,２７(５):５３０Ｇ５３４．W a n g Z H．I n d u c t i o na n d m u t a t i o n m e c h a n i s m o f p l a n t l e s i o n m i m 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n o u s s i g n a l i n t h e r e s i s t a n c e r e s p o n s e of t o b a c c o t o v i r a l i n f e c t i o n．S c i e n c e,１９９０,２５０(４９８３):１００２Ｇ１００４．[７]㊀T a k a h a s h iA,K a w a s a k iT,H e n m iK,e ta l．L e s i o n m i m i c m u t a n t s o f r i c ew i t h a l t e r a t i o n s i n e a r l y s ig n a l i n g e v e n t s o f d eＧf e n s e．P l a n t J,１９９９,１７(５):５３５Ｇ５４５．[８]㊀D a n g l JL,D i e t r i c hRA,R i c h b e r g M H．D e a t hd o n t h a v e n o m e r c y:C e l l d e a t h p r o g r a m si n p l a n tＧm i c r o b ei n t e r a c t i o n s．P l a n tC e l l,１９９６,８(１０):１７９３．[９]㊀N e u f f e rM G,C a l v e r tO H．D o m i n a n t d i s e a s e l e s i o nm i m i c s i n m a i z e．J H e r e d,１９７５,６６(５):２６５Ｇ２７０．[１０]S h i r a s uK,S c h u l z eＧL e f e r t P．R e g u l a t o r s o f c e l l d e a t h i n d i s e a s e r e s i s t a n c e．P l a n tM o lB i o l,２０００,４４(３):３７１Ｇ３８５．[１１]D i e t r i c hR A,R i c h b e r g M H,S c h m i d tR,e t a l．An o v e l z i n cf i ng e r p r o t e i n i se n c o d e db y th e A r a bi d o p s i sL S D１g e n ea n df u n c t i o n sa sa n eg a t i v er e g u l a t o ro f p l a n tc e l ld e a t h．C e l l,１９９７,８８(５):６８５Ｇ６９４．[１２]R y e r s o nDE,H e a t hM C．C l e a v a g e o f n u c l e a r D N A i n t o o l i g oＧn u c l e o s o m a l f r a g m e n t s d u r i n g c e l l d e a t h i n d u c e db y f u n g a l i nＧf e c t i o no r b y a b i o t i c t r e a t m e n t s．P l a n t C e l l,１９９６,８(３):３９３Ｇ４０２．[１３]L a m bC,D i x o nR A．T h eo x i d a t i v eb u r s t i n p l a n td i s e a s e r eＧs i s t a n c e．A n n uR e vP l a n tB i o l,１９９７,４８(１):２５１Ｇ２７５．[１４]王建军,朱旭东,王林友,等．水稻类病变突变体l r d４０的抗５４２张宏根等:水稻类病斑突变体w y３的鉴定和基因定位病性与细胞学分析．中国水稻科学,２００５,１９(２):１１１Ｇ１１６．W a n g J J,Z h uXD,W a n g L Y,e t a l．D i s e a s e r e s i s t a n c e a n dc y t o l o g i c a l a n a l y s e s o n l e s i o n r e s e m b l i n gd i se a s em u t a n t l r d４０i n O r y z a s a t i v a．C h i nJR i c e S c i,２００５,１９:１１１Ｇ１１６．(i nC h iＧn e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t)[１５]陈析丰,金杨,马伯军．水稻类病变突变体及抗病性的研究进展．植物病理学报,２０１１,４１(１):１Ｇ９．C h e nXF,J i nY,M aB J．P r o g r e s s o n t h e s t u d i e s o f r i c e l e s i o nm i m i c s a n d t h e i r r e s i s t a n tm e c h a n i s mt ot h e p a t h o g e n s．A c t a P h y t o p a t h o l S i n,２０１１,４１:１Ｇ９．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s h a bＧs t r a c t)[１６]Q i a oY,J i a n g W,L e e JH,e t a l．S P L２８e n c o d e s ac l a t h r i nＧa s s o c i a t e da d a p t o r p r o t e i n c o m p l e x１,m e d i u m s ub u n i tμ１(A P１M１)a n d i s r e s p o n s i b l e f o r s p o t t e d l e a f a n de a r l y s e n e sＧc e n c e i nr i c e(O r y z as a t i v a)．N e w P h y t o l,２０１０,１８５(１):２５８Ｇ２７４．[１７]W uC,B o r d e o sA,M a d a m b aM RS,e t a l．R i c e l e s i o nm i m i c m u t a n t sw i t he n h a n c e d r e s i s t a n c e t od i s e a s e s．M o lG e n e tG e nＧo m,２００８,２７９(６):６０５Ｇ６１９．[１８]Y i nZ,C h e n J,Z e n g L,e t a l．C h a r a c t e r i z i n g r i c e l e s i o nm i m i c m u t a n t s a n d i d e n t i f y i n g am u t a n tw i t hb r o a dＧs p e c t r u mr e s i s tＧa n c e t o r i c eb l a s t a n d b ac t e r i a l b l i g h t．M o lP l a n tＧM i c r o b e I n t eＧr a c,２０００,１３(８):８６９Ｇ８７６．[１９]李小红,施勇烽,张晓波,等．水稻斑点叶突变体h m１９７的鉴定及其基因定位．中国水稻科学,２０１５,２９(５):４４７Ｇ４５６．L i X H,S h iY F,Z h a n g X B,e ta l．I d e n t i f i c a t i o na n d g e n e m a p p i n g o f as p o t t e dＧl e a fm u t a n t h m１９７i nr i c e．C h i nJR i c e S c i,２０１５,２９(５):４４７Ｇ４５６．(i n C h i n e s e w i t h E n g l i s ha bＧs t r a c t)[２０]C h e nX,H a oL,P a nJ,e t a l．s p l５,a c e l l d e a t ha n dd e f e n s eＧr e l a t e d g e n e,e n c o d e sa p u t a t i v es p l i c i n g f a c t o r３bs u b u n i t３(S F３b３)i n r i c e．M o lB r e e d i n g,２０１２,３０(２):９３９Ｇ９４９．[２１]Y a m a n o u c h iU,Y a n o M,L i n H,e ta l．Ar i c es p o t t e dl e a fg e n e,s p l７,e n c o d e s ah e a t s t r e s s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r p r o t e i n．P N A S,２００２,９９(１１):７５３０Ｇ７５３５．[２２]Z e n g LR,Q uS,B o r d e o sA,e t a l．S p o t t e d l e a f１１,a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f p l a n t c e l l d e a t h a n dd e f e n s e,e n c o d e s aUＧb o x/a rＧm a d i l l o r e p e a t p r o t e i ne n d o w e dw i t hE３u b i q u i t i n l i g a s e a c t i v iＧt y．P l a n tC e l l,２００４,１６(１０):２７９５Ｇ２８０８．[２３]M o r iM,T o m i t aC,S u g i m o t oK,e t a l．I s o l a t i o na n dm o l e c uＧl a r c h a r a c t e r i z a t i o no f a s p o t t e d l e a f１８m u t a n t b y m o d i f i e d a cＧt i v a t i o nＧt a g g i n g i nr i c e．P l a n t M o lB i o l,２００７,６３(６):８４７Ｇ８６０．[２４]T a k a h a s h iA,A g r a w a lG K,Y a m a z a k iM,e ta l．R i c eP t i１a n e g a t i v e l y r e g u l a t e sR A R１Ｇd e p e n d e n t d e f e n s e r e s p o n s e s．P l a n tC e l l,２００７,１９(９):２９４０Ｇ２９５１．[２５]Y i nZ,C h e n J,Z e n g L,e t a l．C h a r a c t e r i z i n g r i c e l e s i o nm i m i c m u t a n t s a n d i d e n t i f y i n g am u t a n tw i t hb r o a dＧs p e c t r u mr e s i s tＧa n c e t o r i c eb l a s t a n d b ac t e r i a l b l i g h t．M o lP l a n tＧM i c r o b e I n t eＧr a c,２０００,１３(８):８６９Ｇ８７６．[２６]L i c h t e n t h a l e rH K．C h l o r o p h y l l s a nd c a r o te n o i d s:P i g m e n t s of p h o t o s y n t h e t i c b i o m e m b r a n e s．M e t h o d s E n z y m o l,１９８７(１４８C):３５０Ｇ３８２．[２７]张志良,瞿伟菁．植物生理学实验指导．北京:高等教育出版社,１９９０．Z h a n g ZL,Q u WJ．P l a n t P h y s i o l o g y E x p e r i m e n t a l G u i d a n c e．３r d e d n．B e i j i n g:H i g h e rE d u c a t i o nP r e s s,２００３．(i nC h i n e s e) [２８]王丹．水稻分蘖调控基因T E的功能分析和类病变突变体l m s１的图位克隆．北京:中国农业科学院,２０１２．W a n g D．F u n c t i o n a l a n a l y s i s o f a k e y t i l l e r i n g r e g u l a t o rT Ea n d m a pＧb a s e d c l o n i n g o f g e n e l m s１i n r i c e(O r z y a s a t i v a L．)．B e iＧj i n g:C A A S,２０１２．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t) [２９]邱结华,马宁,蒋汉伟,等．水稻类病斑突变体l m m４的鉴定及其基因定位．中国水稻科学,２０１４,２８(４):３６７Ｇ３７６．Q i uJ H,M a N,J i a n g H W,e ta l．I d e n t i f i c a t i o na n d g e n e m a p p i n g o f a l e s i o n m i m i cm u t a n t l m m４i nr i c e．C h i nJR i c e S c i,２０１４,２８(４):３６７Ｇ３７６．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s h a b s t r a c t) [３０]钟振泉,罗文龙,刘永柱,等．一份新的水稻斑点叶突变体s p l３２的鉴定和基因定位．作物学报,２０１５,４１(６):８６１Ｇ８７１．Z h o n g ZQ,L u oW L,L i uYZ,e t a l．C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n oＧv e l s p o t t e d l e a fm u t a n t s p l３２a n dm a p p i n g o f s p l３２(t)g e n e i n r i c e(O r y z a s a t i v a)．A c t aA g r o nS i n,２０１５,４１(６):８６１Ｇ８７１．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t)[３１]刘林．水稻类病变突变体g３４０的鉴定和基因定位．北京:中国农业科学院,２０１４．L i uL．I d e n t i f i c a t i o na n d g e n e m a p p i n g o f ar i c e l e s i o n m i m i c m u t a n t g３４０．B e i j i n g:C A A S,２０１４(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t)[３２]代高猛,朱小燕,李云峰,等．水稻类病斑突变体s p l３１的遗传分析与基因定位．作物学报,２０１３,３９(７):１２２３Ｇ１２３０．D a iG M,Z h uX Y,L iY F,e ta l．G e n e t i ca n a l y s i sa n df i n em a p p i n g o f a l e s i o n m i m i cm u t a n t s p l３１i nr i c e．A c t aA g r o n S i n,２０１３,３９(７):１２２３Ｇ１２３０．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha bＧs t r a c t)[３３]S a m u i l o vV D,K i s e l e v s k y DB,S i n i t s y nSV,e t a l．H２O２i nＧt e n s i f i e sC N－Ｇi n d u c e d a p o p t o s i s i n p e a l e a v e s．B i o c h e m(M o sＧc o w),２００６,７１(４):３８４Ｇ３９４．[３４]W a n g L,P e i ZY,H eC．O s L S D１,a r i c e z i n c f i n g e r p r o t e i n, r e g u l a t e s p r o g r a mm e d c e l ld e a t h a n d c a l l u s d i f f e r e n t i a t i o n．M o lP l a n tＧM i c r o b e I n t e r a c,２００５,１８(５):３７５Ｇ３８４．[３５]K o j oK,Y a e n oT,K u s u m iK,e t a l．R e g u l a t o r y m e c h a n i s m s o fR O I g e n e r a t i o na r ea f f e c t e db y r i c e s p l m u t a t i o n s．P l a n tC e l lP h y s i o l,２００６,４７(８):１０３５Ｇ１０４４．[３６]L i uX,L iF,T a n g J,e ta l．A c t i v a t i o no f t h e j a s m o n i ca c i d p a t h w a y b y d e p l e t i o no f t h e h y d r o p e r o x i d e l y a s e O s HP L３r eＧv e a l s c r o s s t a l kb e t w e e n t h eH P La n dA O Sb r a n c h e s o f t h e o xＧy l i p i n p a t h w a y i n r i c e．P L o SO N E,２０１２,７(１１):１Ｇ１４．[３７]T o n g X,Q i J,Z h uX,e t a l．T h e r i c e h y d r o p e r o x i d e l y a s e O sＧHP L３f u n c t i o n s i nd e f e n s er e s p o n s e sb y m o d u l a t i n g t h eo x yＧl i p i n p a t h w a y．P l a n t J,２０１２,７１(５):７６３Ｇ７７５．６４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第３０卷第３期(２０１６年５月)。
一个水稻白化致死突变体abl25鉴定及其基因定位
一个水稻白化致死突变体abl25鉴定及其基因定位作者：朱环环 刘艳霞等来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2014年第03期摘要：经Co60辐照的粳稻嘉花1号得到一个新的致死白化突变体albino lethal 25（abl25），该突变体从发芽至4叶期表现为白化苗，之后逐渐死亡.与野生型嘉花1号相比，abl25突变体的叶绿素含量和类胡萝卜素的含量大大降低，叶绿体结构不正常，说明其叶绿体发育受到严重阻碍，导致植物死亡.遗传分析表明：该突变体受一对隐性核基因（abl25）控制，进一步利用abl25与广占63S杂交的F2分离群体，将该突变体基因（abl25）定位于第2染色体上SSR标记RM424与Indel分子标记ID7330之间，随后利用新开发的分子标记和扩大群体将其定位在Indel分子标记ID9111和ID9261之间的150 kb内，发现abl25是一个新的水稻苗期白化致死基因.关键词：水稻；叶绿体；白化致死突变体；基因定位中图分类号： Q 344 文献标识码： A 文章编号： 10005137（2014）030238070 引言叶绿体是个半自主细胞器，它不仅是光合作用的重要场所，而且还负责各种代谢物的生物合成和储存[1]，一个具有光合活性的叶绿体的生成，需要光、质体和核基因组的控制，并伴随着类囊体膜的产生[2-3].越来越多的证据表明，叶绿体的生成是个高度被监管的过程，包括基因表达，蛋白生物合成以及选择性的蛋白质降解[4].所以，当叶绿体的发育受到阻碍的时候，会影响叶绿素合成，从而引起叶色异常[5-6]，甚至导致植株死亡[7].很多与叶绿体相关水稻突变体已经被发现，并根据不同的表型被命名为virescent （v），stripe （st），albino，chlorina，zebra，and yellowvariegated[8].在这些突变体中，v突变体在叶片生长早期表现为叶绿体不足，在后期生长中会产生大部分的绿色叶片[9].St为条纹状叶片突变体；chl突变体会产生淡绿色苗，是由于叶绿素的合成出现了问题[10]；至于zebra和 yellow variegated突变体，发生后大都不会导致它们的死亡.而水稻白化苗（albino），叶片一产生就发生白化，大多数在三叶期枯死.关于水稻白化突变体的研究目前也取得一些进展，日本的Iwata[12-13]等报道的11个水稻白化突变体al1al11，其突变基因位于第1，4，5，6号等染色体.夏久成等将一个返绿的白化突变基因al12，定位在第8染色体上[11].另外，通过白化致死突变体abl4 对研究，发现编码的ABL4蛋白定位于类囊体膜，推测ABL4基因是叶绿体正常发育过程所必需的[14].余庆波等将水稻白化突变体alb21的突变基因定位在第3染色体，并发现其叶绿体中只有一些空泡状结构[15]；白化突变体osalb23被定位在第2染色体上[16].巩孝帝[17]等水稻白化突变体asl1基因定在第1染色体，是编码核糖体白蛋白基因突变引起.本研究发现并鉴定了一个水稻白化苗突变体abl25，它的白化致死表型不受温度影响，对白化苗突变体的叶色表型、叶绿素水平，叶绿体超微显微镜进行观察和分析，并利用了SSR及InDel分子标记对该突变基因进行了定位，为该基因的分子克隆及其作用机理的研究奠定基础.1 材料与方法1.1 材料突变体abl25从粳稻“嘉花1号”干种子经60Coγ射线辐照后代获得.嘉花种子经过辐照之后发生突变（Aa），进行自交之后选取苗期分离出白化突变体的株系（上一代为杂合单株），随机选取4株生长正常的单株挂牌，收获挂牌的单株种子播种，根据后代分离情况确定上一代的基因型，弃纯合野生型单株，保留杂合单株.之后，突变体杂合子与籼稻广占63S杂交，得到F1代种子，自交后得到F2代分离群体，用于遗传分析与基因定位.1.2 方法1.2.1 突变体的表型观察为了进一步确定突变体abl25的表型，将突变体杂合子及其野生型嘉花1号的种子在32 ℃条件下催芽4 d后，播种在装有水稻土的塑料盆内，因为有好多温敏感的突变体被报道，为排除这种温度差异，将abl25突变体放置在20、24、28、32 ℃的光照培养箱（GXZ智能型，宁波，江南仪器厂）内，每天12 h光照（光照强度为180 μmol/m2·s）和自然条件（25 ℃）下，进行培养，观察突变体及其野生型叶色变化，并对其进行拍照.1.2.2 叶片光合色素含量的测定在上述32 ℃培养条件下，待突变体abl25与野生型嘉花1号长至3叶期时，参照沈伟其[18]描述的水稻叶片叶绿素浸提法.具体为取新鲜叶子1 g，加4倍的100%丙酮和少许石英砂进行在低温下研磨，收集匀浆液；倒入10 mL离心管中3000 r/15 min低温离心后取上清；若离心后沉淀物还呈现绿色则继续研磨离心，直至离心后下层无绿色为止.所有的上清用80%丙酮定容至50 mL，然后测吸光值.然后使用BECKMANCOULTERDU720分光光度计分别测定470、645、663 nm 3个波长下的吸光值，分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，重复3次，取其均值.1.2.3 叶绿体显微结构观察取上述在32 ℃条件下生长3周的野生型与abl25突变体叶片，用2.5%戊二醛和l %四氧化锇磷酸缓冲液4°下固定5 h后，用50%，70%，80%，95%，100%的乙醇和丙酮梯度下进行脱水，逐级脱5 min，最后用环氧化树脂包埋样品，切片后，经醋酸铀-柠檬酸铅双染色后，Hitachi765型透射电镜进行观察和拍照.1.2.4 构建定位群体突变体杂合子（ABL25/abl25）与籼稻广占63S杂交获得F1种子，收获单株种子播种，根据后代分离情况确定上一代的基因型，只保留杂合基因型（ABL25/abl25）的杂交种，获得能用于遗传分析F2代群体，选取表现为白化突变的单株提取DNA.1.2.5 水稻DNA的提取采用TPS法[19]以及CTAB[20]法，提取亲本以及F2代遗传群体基因组DNA.1.2.6 基因定位本研究中，首先选取本实验室的保存SSR及InDel的分子标记检测突变体abl25和广占63S的多态性，然后选取均匀分布在水稻12条染色体上的有多态性的引物，然后，随机挑选F2中分离出22株白化苗作连锁分析，确定突变基因在那条染色体上，接着进一步扩大F2群体进行遗传定位.在目标区域内通过 NCB公布的粳稻日本晴和籼稻9311的全基因组序列的差异InDel 位点，利用Primer Premier 5.0软件设计引物[引物由上海生工生物工程技术服务公司合成]（表 2），对突变基因进行进一步定位，应用MAPMAKER/EXP3.0[21]软件，构建目的基因区域的遗传图谱.PCR反应体系包括：100 mmol/L TrisHCl（pH=9.0）、100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、80 mmol/L （NH4）2SO4、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/mL Taq酶和20 ng模板DNA.在Eppendorf 和东胜PCR仪上进行扩增，PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s（退火温度随不同引物变化），72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min.反应产物用2.5%～3.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，而对于多态性不明显的引物的PCR产物，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染之后用冷光源胶片观察灯观察，并拍照记录.2 结果与分析2.1 突变体的表型鉴定在20，24，28，32 ℃人工气候箱条件下以及自然条件下生长的突变体苗期表型均一致，不论发芽后首先长出的叶鞘，还是不完全叶，以及第2、3叶完全为白色，3叶期后，突变体逐渐死亡（图1），表明突变体abl25叶色的变化不受温度及其他外部条件所改变，是水稻苗期白化致死突变体.图1 abl25突变体的表型2.2 突变体光合色素的含量变化为了探究突变体中光合色素含量的变化，测定了野生型嘉花1号与突变型abl25的叶绿素，类胡萝卜素的含量，结果显示突变体abl25的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量明显低于正常水平，与野生型形成鲜明比对（表1），说明突变体中叶绿素的含量明显降低，可能为叶绿素合成受到的影响而导致.2.3 abl25叶绿体超细微结构的变化通过透射电镜观察野生型嘉花1号与abl25突变体的叶绿体超微结构发现，野生型嘉花1号的叶绿体密度无明显缺陷，可以看到井然有序的类囊体堆叠，而abl25突变体中无明显的类囊体堆叠结构，只有些空泡结构（图2）.这说明叶绿体的发育受到严重阻碍，导致abl25叶片内没有正常的叶绿体产生，叶绿素更是无法正常合成.2.4 遗传分析及基因定位在突变体杂合子分离后代中，绿色正常和白化致死苗分别为32和12株，其分离比符合3∶1（χ2=0.09图2 野生型和abl25突变体叶绿体的超微结构选取22株F2代白化苗进行粗定位分析，发现水稻第2染色体上的分子标记RM424，RM475（图3）有强烈的偏态扩增，因此，判断abl25位于第2染色体，然后扩大群体198株（图4A），将该基因定位在ID9047与 ID10317之间，其遗传距离分别为0.8 和8.4 cM.为了精细定位目标基因区域，定位群体扩大至4700株，将突变基因定位在ID9111到ID9261之间，物理距离约为150 kb（图4B），并发现ID9234与突变基因共分离.根据http：//ricegaas.dna.affrc.go.jp/和 http：//在该区间跨越了2个不重叠的BAC （AP005777.2和AP005631.3）克隆群，预测包含23个候选基因.3 讨论水稻不仅是重要的粮食作物，也是单子叶植物和禾本科的模式植物，水稻叶色突变体，越来越引起人们的研究兴趣，但是只有很少一部分白化突变体能够从分子水平作出阐释.比如，水稻白化突变体alb21无完整的叶绿体结构，只是些空泡结构，其定位在第3染色体上1520 kb 的区域内[14].同样的，abl4白化致死突变体没有成熟的叶绿体结构，只有些类似前质体的结构，以及部分囊泡状结构，定位第4染色体210 kb内；目前较为详细的是对白化突变体asl1的研究，表明asl1白化突变体是由编码核糖体白蛋白基因突变引起[17].到目前为止，与本研究abl25定位于同条染色体的已知突变基因有alb23[15]，其叶绿体中无类囊体及其他颗粒，定位在280 kb的区间内；以及gra（t）[22]，其在三叶期之前表现为白化苗，三叶期之后渐渐恢复绿色表型，定位于42.3 kb区间内.都与本文研究所确定在ID9111到ID9261之间150 kb内的位置完全不同，因此，abl25是一个新的白化突变基因.通过对ID9111到ID9261之间的生物信息学预测，发现其中共有23个候选基因，包括功能未知蛋白3个，其余20个编码蛋白的基因中，通过前导肽预测显示有1个叶绿体基因（LOC_Os02g16250）（http：//ipsort.hgc.jp/），查阅水稻基因表达预测网站（http：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/categoryselect.php）发现在叶片中高表达的基因有LOC_Os02g15660，LOC_Os02g15880，LOC_Os02g15900 LOC_Os02g16060，LOC_Os02g16250，通过对上述相关基因测序对比，显示在野生型和abl25突变体中没有差异，这说明上述候选基因可能与abl25白化致死无关.由于叶绿体自身所含有的蛋白或者定位于叶绿体以外的蛋白都可能影响植物叶绿体的正常发育[5].因此导致abl25白化致死的真正原因更是难以断定，有可能不是叶绿体蛋白基因突变引起的.本研究发现的abl25突变体，叶绿素和胡萝卜素的含量大大降低（图1），叶肉细胞超显微电镜观察发现突变体叶绿体中无任何堆叠的类囊体结构，叶绿体的形态不正常（图2），这都表明突变体的叶绿体形成在叶片发育过程中受到严重阻碍，导致叶绿素无法正常合成.更有趣的，定位过程发现在候选目标基因所在的9003～9234 kb区域之间，引物扩增的野生型DNA 条带非常清晰，而abl25突变体中暗淡或不清楚，推测ABL25基因的突变可能会对基因组的复制产生消极影响，影响突变体某些基因DNA的合成，类似现象在水稻virescent （v3）突变体到得证明[8]，但对于abl25来说还需要进一步验证.今后，将在此基础上扩大定位群体，发展更多新的分子标记，进一步对该基因进行克隆和功能分析，将有助于加深对水稻苗期白化致死作用机理的了解.参考文献：[1] MULLET J E.Dynamic regulation of chloroplast transcription[J].Plant Physiology，1993，103（2）：309-313.[2] LPEZJUEZ E.Plastid biogenesis，between light and shadows[J].Journal of Experimental Botany，2007，58（1）：11-26.[3] SAKAMOTO W，MIYAGISHIMA S，JARVIS P.Chloroplast biogenesis：control of plastid development，protein import，division and inheritance[J].The Arabidopsis Book，2008，6：e0110.[4] KATO Y，SAKAMOTO W.A new insights into the types and function of proteases 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水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体是一种新出现的突变体，其叶片呈现卷曲现象，同时具有部分不育性状。
本文对该突变体进行了鉴定及初步遗传分析。
首先，利用形态特征和生理生化指标对该突变体进行了鉴定。
结果表明，该突变体与野生型水稻在生长期、叶片形态、根系结构等方面存在明显差异。
同时，在花粉染色体观察中，发现突变体的部分花粉染色体呈现不完整的二倍体结构，这也表明了该突变体的部分不育性质。
此外，利用电子显微镜观察了突变体和野生型水稻之间的差异，发现突变体细胞膜结构和细胞质器结构异常，这可能是导致该突变体不育性质的原因之一。
随后，利用遗传分析方法对该突变体进行了初步探究。
首先，将该突变体与野生型水稻进行杂交，并对F1、F2代进行分析。
结果表明，F1代呈现杂种优势，同时显示出部分突变体表型。
在F2代中，突变体和野生型水稻的比例接近3:1，符合单基因控制的遗传规律。
此外，在进行备选杂交时，突变体与其它突变体或野生型水稻进行杂交，可以看出该突变体因为受到单一隐性基因的控制，表现出了统一的遗传规律。
综上，本文通过形态和生理生化特征的鉴定、花粉染色体观察、电子显微镜技术及遗传分析等方法，初步探究了水稻卷叶半不育突变体的性状及遗传规律。
为深入挖掘该突变体的潜在价值并探究其内部遗传机制提供了一定的参考和指导。
水稻Dwarf1移码突变的新突变体鉴定
HEREDITAS (Beijing) 2011年4月, 33(4): 397―403 ISSN 0253-9772 研究报告收稿日期: 2010−09−30; 修回日期: 2010−12−10基金项目:国家自然科学基金项目(编号：30971749)和国家973项目(编号：2010CB125901)及转基因生物新品种培育重大专项(编号：2008ZX08009-001)资助作者简介:陈华夏, 硕士, 研究方向：遗传学。
E-mail: chenhuaxia@周成博，学士，研究方向：遗传学。
E-mail: zhouchengbo@ 陈华夏和周成博同为第一作者。
通讯作者:邢永忠, 博士, 博士生导师, 研究方向：分子遗传学。
E-mail: yzxing@DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00397水稻Dwarf1移码突变的新突变体鉴定陈华夏, 周成博, 邢永忠华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 国家植物基因中心(武汉), 武汉 430070摘要: 从一批水稻品种“中花11” 组织培养苗里分离到一个矮化突变株“C6PS ”, 它的T 2代群体株高呈现3:1分离。
利用该群体矮化单株与“珍汕97”、“牡丹江8”构建2个F 2群体F 2(CZ)、F 2(CM), 两个群体中高株与矮株均呈现3:1分离, 证明该性状变异为单基因控制。
“C6PS ” 表现型与已经报道的Dwarf1隐性突变体“d1”相似, 以D1附近标记RM430检测F 2(CZ) 群体基因型, 结果显示群体表型与RM430基因型呈极显著相关(P =0.0001), 将该基因初步定位于Dwarf1附近。
对“C6PS ”及“中花11”进行D1序列分析显示, 突变株中D1基因在其第九个外显子与第九个内含子的剪接位点上发生6个碱基的缺失, 根据缺失两侧序列设计C6PS-D1L/R 标记, 在T 2代群体该标记与表型呈现共分离, 表明“C6PS ”是一种新的Dwarf1突变体。
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体是指水稻植株在生长发育过程中出现卷叶并且部分不育的现象。
该突变体的出现对于水稻的研究具有重要意义，可以为水稻的育种和遗传研究提供新的材料。
对于水稻卷叶半不育突变体的鉴定，可以通过对植株的形态进行观察和比较。
卷叶突
变体的特点是叶片呈现松软的弯曲状态，与正常水稻的叶片形态有明显区别。
半不育突变
体的雄穗或者雄蕊发育异常，无法正常产生粉粒。
通过这些形态特征的观察和记录，可以
初步确定是否为卷叶半不育突变体。
可以通过对卷叶半不育突变体植株进行组织解剖，进一步确定该突变体的特征。
组织
解剖可以观察卷叶突变体的叶片细胞结构是否正常，叶肉中细胞是否充实等情况。
还可以
观察突变体的花药和雄蕊发育情况，是否与正常水稻有明显差异。
组织解剖可以提供更加
详细和准确的信息，帮助进一步确定卷叶半不育突变体。
需要进行遗传分析来确定卷叶半不育突变体的遗传特性。
可以通过对该突变体与正常
水稻的杂交实验来观察其子代的表现，并且根据子代的表现来推测该突变体的遗传特性。
如果卷叶半不育突变体的子代中出现了卷叶半不育特征，并且世代间稳定传递，那么可以
推测该特征是由突变体的基因所控制。
通过以上的鉴定方法和初步遗传分析，可以确定水稻卷叶半不育突变体的特征和遗传
特性。
这对于深入研究该突变体的发生机制、遗传基础以及其对水稻产量和品质的影响具
有重要意义。
还可以利用该突变体进行育种和遗传改良，为水稻的产量和品质提供新的途径。
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析水稻是世界上最重要的粮食作物之一，它是全球人类的主要粮食来源之一。
水稻卷叶半不育突变体是一种常见的水稻不育突变体，其对水稻产量和品质有着严重的影响。
对水稻卷叶半不育突变体进行鉴定和遗传分析，对于水稻产量和品质改良具有重要的意义。
（一）形态特征鉴定水稻卷叶半不育突变体的表型特征主要表现为水稻叶片呈现卷曲、卷缩的现象，严重影响叶片的光合作用和养分吸收。
水稻卷叶半不育突变体的花药发育也呈现异常，花药小而褐色，且不育率较高。
通过对不同的品种和材料进行相关的形态特征观察和比较分析，可以初步确定水稻卷叶半不育突变体的鉴定。
（二）生理生化特征鉴定水稻卷叶半不育突变体的生理生化特征是其的重要鉴定信息。
通过对水稻叶片和花药中相关生理指标的测定，比如叶绿素含量、光合速率、氧化还原酶活性等，可以对水稻卷叶半不育突变体进行生理生化特征的鉴定。
（三）遗传分析鉴定对水稻卷叶半不育突变体进行遗传分析是其鉴定的重要手段。
通过对不育系和育性系进行杂交，结合对F1和F2代的观察和分析，可以初步确定水稻卷叶半不育突变体的遗传模式和遗传规律。
（一）遗传分析实验设计1. 选择不同的水稻品种和材料，包括卷叶半不育突变体、不育系和育性系等。
2. 进行不同品种和材料之间的杂交，并培育F1和F2代。
3. 对F1和F2代进行相关形态特征和生理生化特征的观察和分析。
（二）结果分析通过对F1和F2代的观察和分析，可以得到以下初步的遗传规律：1. 水稻卷叶半不育突变体的不育性状具有显性遗传特点，F1代均表现为不育型。
2. F2代中出现了不育型和育性型的个体，且不育型和育性型的比例约为3:1，符合孟德尔遗传定律。
（三）初步讨论通过初步的遗传分析，可以得知水稻卷叶半不育突变体的不育性状表现为半显性遗传，且其遗传规律符合孟德尔遗传定律。
这为今后进一步深入研究水稻卷叶半不育突变体的遗传特点和遗传机制提供了重要的基础数据。
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析水稻叶卷半不育突变体是指在生长发育过程中，部分或全部的叶片畸形卷曲，同时伴随着雄蕊退化，只有部分花药发育正常，导致该突变体无法正常进行有性繁殖。
本文主要介绍了如何鉴定水稻叶卷半不育突变体，并对其进行初步遗传分析。
一、鉴定方法1. 外观观察法在水稻生长发育期间，观察其是否存在叶片卷曲现象，并观察其是否有雄蕊退化现象，若有，则具备半不育突变特征。
2. 质量测定法测定其籽粒质量、收获量、种子质量等质量指标是否有明显差异，若有，则说明该突变体存在半不育现象。
3. 细胞学检测法采用荧光原位杂交技术或染色体观察技术，观察其染色体形态与数量是否异常，若有，则说明该突变体呈现出半不育的特征。
二、遗传分析水稻叶卷半不育突变体的遗传机制并不清楚，但根据文献报道和实验室实践，一般认为存在以下几种遗传模式。
1. 单基因显性遗传该模式认为该突变体是由单个基因的显性突变所导致，突变基因呈现出完全显性或不完全显性表达，且不存在隐性等位基因。
经过后代分析，半不育性状能够稳定遗传，符合单基因显性遗传规律。
该模式认为该突变体是由多个基因的突变所导致，这些突变基因呈现出累积效应，只有在突变基因数量达到一定水平时，才能观察到半不育性状。
以上三种遗传模式的具体遗传效应，需要通过后代分析来进一步验证。
通过交叉组合突变体和正常品种，分析各组倍型组成及表型表现规律，可初步判断半不育性状的遗传模式。
三、结论水稻叶卷半不育突变体是一种重要的研究材料，在水稻遗传育种研究中发挥着重要的作用。
本文介绍了鉴定该突变体的几种方法，并探讨了其遗传特点，希望能够为相关研究提供一定的参考。
一个水稻类病变黄叶突变体的鉴定和精细定位
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水稻抗逆突变体筛选和鉴定方法研究
水稻抗逆突变体筛选和鉴定方法研究一、引言水稻是我国最主要的粮食作物之一，也是世界上最主要的粮食之一。
然而，水稻生长过程中面临的各种压力和恶劣环境，如盐碱、干旱、低温等，极大地影响了其生长和发育，从而限制了生产能力和产量。
近年来，众多研究表明，水稻抗逆性突变体在抵御各种生物和非生物胁迫方面具有潜在的生物学应用价值，因此对于水稻抗逆突变体的筛选和鉴定方法的研究具有重要的科学意义和应用价值。
二、水稻抗逆突变体的筛选方法1. 化学诱变法化学诱变法通常是使用化学物质诱导植物发生基因突变，并在遗传水平上获得新性状。
根据现有文献，氨基甲酸（EMS）和亚硝基尿酸（MNU）是常用的水稻化学诱变剂。
在诱变过程中，给定浓度的诱变剂通常会直接处理种子、幼苗或嫩叶，以诱导突变。
依据化学物质浓度、诱变剂喷雾时间、喷雾频率等，可以筛选出抗逆性不同的突变体。
2. 物理诱变法物理诱变法以其通过以壳膜等介质传递核酸分子，破坏DNA ，诱导基因突变的有效性而备受青睐。
常见的物理诱变法包括辐射材料和电离辐射诱变等。
物理诱变法的结果指的是产生的较高突变频率。
3. 转基因技术转基因技术是目前最高效、最可靠的水稻抗逆性育性筛选方法。
它基于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，已成功产生了复杂基因组型突变体水稻。
这种技术的优点是可以精确定位和编辑某些重要基因片段，从而获得更好的抗逆性和其他生物学特性。
但是，这种技术需要精确的操作和实验技术，其困难在于难以准确指定目标基因及其突变形式。
三、水稻抗逆突变体的鉴定方法1. 遗传分析法遗传分析法是水稻抗逆突变体鉴定中常用的方法之一。
遗传学分析方法包括突变显性、相关基因分析、连锁分析以及遗传背景分析等。
通过遗传分析，能够确定水稻株系、突变率及突变性状等，在一定程度上指导后续的研究与开发。
2. 生理生化检测法生理生化检测法可以在分子和化学水平上检测水稻抗逆性突变体的生物学特性。
例如，通过测量植株生长参数、色素含量、甘露醇、多酚等物质的含量、电解质渗漏率和活性氧含量等，可以评估突变体的生理和生化变化。
一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位_百度概要
HEREDI T AS (Be i j i n g 2012年 8月, 34(8: 1064― 1072ISSN 0253-9772 研究报告收稿日期: 2012−05−11; 修回日期: 2012−05−20基金项目 :福建省自然科学基金项目 (编号:2011J01110, 福建省农业科学院青年人才创新基金项目 (编号:2010QJ-A4 , 福建省农业科学院科技创新团队建设重点科研项目 (编号:CXTD2011-12 资助作者简介 :杨德卫 , 硕士 , 助理研究员 , 研究方向:水稻遗传育种。
E-mail: dewei-y@通讯作者 :叶新福 , 博士 , 研究员 , 研究方向:水稻遗传育种。
E-mail:yexinfu@网络出版时间 : 2012-7-16 10:34:50URL: /kcms/detail/11.1913.R.20120716.1034.003.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.01064一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位杨德卫 , 卢礼斌 , 程朝平 , 曾美娟 , 郑向华 , 叶宁 , 刘成德 , 叶新福福建省农业科学院水稻研究所 , 福州 350018摘要: 水稻产量和品质受花器官发育的直接影响 , 因此对水稻颖花发育机理的研究将有助于水稻产量提高和品质的改良。
文章利用60Co γ射线辐照亲本 8PW33 (籼稻背景获得一个性状能稳定遗传的内颖退化突变体 (编号:MU102, 并对其农艺性状和花器官进行了观察和分析。
结果显示 , 相对于野生型 , 该突变体的株高、每穗总粒数及剑叶宽均显著增加 , 而结实率则显著降低 , 差异均达显著水平。
解剖镜下观察表明 , 该突变体内颖退化 , 外颖弯曲呈现镰刀状 , 其余器官与野生型表型基本一致。
扫描电镜观察显示 , 突变体与野生型叶片维管束的结构组成以及外颖表皮细胞组成、排列均正常 , 没有明显差异 ; 与野生型相比 ,突变体内颖表皮细胞排列较为紧密 , 推测可能是内颖收缩退化导致的。
水稻卷叶突变体rl76的表型和组织分析及基因定位
水稻卷叶突变体rl76的表型和组织分析及基因定位目录一、内容综述 (2)1. 研究背景及意义 (3)2. 研究目的和任务 (4)二、水稻卷叶突变体rl76的表型分析 (4)1. 突变体的形态特征 (5)1.1 叶片形态变化 (6)1.2 植株整体形态变化 (7)2. 突变体的生物学特性 (8)2.1 生长周期变化 (10)2.2 生物量变化 (11)三、水稻卷叶突变体rl76的组织分析 (12)1. 组织结构观察 (13)1.1 叶片结构变化 (14)1.2 茎秆及根系结构变化 (15)2. 组织化学分析 (16)2.1 生化成分分析 (17)2.2 细胞壁组分变化 (18)四、水稻卷叶突变体rl76的基因定位 (19)1. 遗传背景分析 (20)1.1 遗传图谱构建 (21)1.2 遗传标记选择及定位群体构建 (22)2. 基因定位方法与技术 (23)2.1 基于分子标记的基因定位技术 (24)2.2 基于高通量测序的基因定位方法 (24)五、基因定位结果及功能分析 (26)一、内容综述水稻卷叶突变体rl76作为一种重要的农艺性状变异，在植物生物学、遗传学和分子生物学领域引起了广泛关注。
该突变体的研究不仅有助于深入了解水稻叶片发育的分子机制，而且对于作物遗传改良和抗逆性育种具有潜在的应用价值。
本文将对水稻卷叶突变体rl76的表型特征、组织结构变化以及基因定位进行综述。
在表型特征方面，rl76突变体在水稻叶片发育过程中表现出明显的卷叶现象。
这种卷叶表型可能表现为叶片弯曲、扭曲或翻滚，与正常叶片相比，突变体叶片的形态和生长方向发生显著改变。
rl76突变体可能还伴有其他相关表型变化，如株高、穗形、粒型等，这些表型变化可能与卷叶表型存在某种程度的关联。
在组织结构分析方面，rl76突变体的叶片结构与正常叶片相比存在显著差异。
通过显微观察，可以发现突变体叶片的细胞形态、排列以及组织结构发生变化。
细胞大小、形状、排列方式以及叶绿体的发育可能受到影响，这些变化可能与卷叶表型直接相关。
EMS诱变水稻突变体致变基因的鉴定0725
EMS突变体致变基因鉴定在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。
采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。
在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。
常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。
随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。
根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略：方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。
方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。
该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。
变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。
方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量又可降低测序成本。
由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。
水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。
该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析1. 引言1.1 背景水稻（Oryza sativa L.）作为世界上最重要的粮食作物之一，对于人类的生存和发展起着至关重要的作用。
生育不良一直是限制水稻产量和品质提高的重要因素之一。
水稻卷叶半不育突变体是一类特殊的不育变异类型，在水稻遗传研究和育种中具有重要意义。
水稻卷叶半不育突变体的表型特征是叶片呈现卷曲状，同时部分雄蕊退化，导致花粉营养不足，从而影响了正常的受精过程。
该突变体的特殊表型使其成为研究水稻不育机制的理想材料，也为水稻优异基因的发现和应用提供了新的途径。
随着分子生物学和遗传学研究方法的不断进步，对水稻卷叶半不育突变体进行鉴定、特征分析、遗传分析、分子机制研究以及潜在应用价值的深入探讨，将有助于揭示其不育机制，为水稻的遗传改良和育种提供新的思路和方法。
本研究旨在对水稻卷叶半不育突变体进行全面系统的研究，为水稻生育不良的解决提供理论和实践基础。
1.2 研究目的水稻卷叶半不育突变体是水稻中一种重要的遗传变异类型，其不仅对水稻的生长发育过程产生了影响，也为水稻的遗传改良提供了新的可能性。
本研究旨在通过对水稻卷叶半不育突变体的鉴定及遗传分析，揭示其遗传机制和分子机制，为进一步探究水稻遗传调控提供重要线索。
通过对水稻卷叶半不育突变体的特征分析和潜在应用价值研究，旨在发掘其在育种领域的应用潜力，为水稻育种工作提供新的思路和技术支持。
通过对水稻卷叶半不育突变体进行系统的研究，将有助于深入了解水稻的遗传调控机制，为水稻产量和质量的提升提供理论基础和实践指导。
【2000字，结束】1.3 研究方法研究方法是本研究的核心部分，是为了解决水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析而提出的具体研究步骤和操作流程。
本研究方法主要包括样品收集、基因分析、遗传图谱构建等几个关键步骤。
样品收集是本研究的起始阶段。
我们从自然界中广泛收集水稻卷叶半不育突变体样品，并确保样品的代表性和多样性，以便后续的实验研究。
水稻突变体介绍及鉴定(很详细)
RMD水稻突变体信息及基因型鉴定1.背景介绍：突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。
植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。
为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。
2.原理：2.1农杆菌介导的T-DNA 插入农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。
1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。
Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。
研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。
T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。
我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。
大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。
由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。
我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。
2.2 水稻Tos17 反转录转座子创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。
水稻变异株遗传变异类型的鉴定实验报告
水稻变异株遗传变异类型的鉴定实验报告水稻是我国主要的粮食作物之一，其产量和品质对于保障人民的饮食安全至关重要。
然而，水稻遗传变异的存在为育种工作提供了很好的资源。
通过对水稻变异株的鉴定实验，我们可以深入了解水稻的遗传变异类型，为育种工作提供重要的依据。
本实验旨在探究水稻遗传变异的类型，并通过实验鉴定来验证。
实验材料：1.水稻变异株：本实验选取了10个具有不同变异特征的水稻株，分别标记为M1至M10。
2.相关实验设备和试剂。
实验步骤：步骤一：水稻变异株的观察首先，对每个水稻变异株进行外部形态特征的观察和记录。
包括株高、叶形、茎色、叶色等特征。
通过这些观察可以初步了解水稻变异株的差异和特征。
步骤二：基因型分析对于已知的突变水稻株，我们可以利用相应的分子生物学方法进行基因型分析。
例如，利用PCR方法扩增目标基因区域，并通过测序来确认其基因型。
步骤三：遗传变异类型的鉴定根据步骤一和步骤二的结果，我们可以初步判断水稻变异株的遗传变异类型。
根据遗传变异类型的不同，可将其分为以下几类：1.突变体：指具有单个基因突变导致的变异。
突变体在形态特征上与野生型有较大的差异，通常表现为株高、叶色、叶形等方面的突变。
例如，突变体M1呈现出丰满的穗型和无颖粒的特征。
2.染色体缺失体：染色体缺失体是由于染色体结构发生异常导致的遗传变异。
通过核型分析和染色体组型研究，可以确定染色体缺失体的存在。
例如，染色体缺失体M2呈现出染色体数目减少和核型异常的特征。
3.染色体易位体：染色体易位体是指染色体片段在同一染色体上的重新排列。
通过核型分析和染色体组型研究，可以确定染色体易位体的存在。
例如，染色体易位体M3呈现出染色体同源片段的重组特征。
4.多倍体：多倍体是指具有多套染色体的遗传变异体。
多倍体的存在可以通过核型分析和染色体数目研究得到证实。
例如，多倍体M4呈现出核型含有多套染色体的特征。
步骤四：统计和分析根据步骤三的鉴定结果，我们可以对不同遗传变异类型的水稻变异株进行统计和分析。
水稻Ds标记的曲穗突变体的分子鉴定-文档(可编辑修改word版)
水稻Ds标记的曲穗突变体的分子鉴定在20世纪五六十年代，我国利用半矮化育种及水稻杂种优势技术，水稻产量有很大的提高，但近年来，水稻产量一直处于停滞不前的状态[2]。
株型育种是水稻超高产遗传育种的重要方向，而穗型与水稻株型密切相关，是影响水稻产量的重要因素之一。
因而，通过对穗型的研究进而提高水稻产量是很多育种专家所重视的问题。
在水稻发育生物学研究及实际农业生产中，与弯曲穗型水稻比较而言，直立穗型能够改善灌浆结实期群体结构，增强抗倒伏性，提高群体生长率等生理生态特性，但大多数的研究只是简单地运用统计学对其性状进行简单考察，对直立穗型和曲穗型分子机制方面的研究较少[3-5]。
阐明相关穗弯曲与穗直立基因的遗传机理，为水稻育种研究提供参考依据，这也是研究优质高产水稻的未来研究方向。
本研究对水稻Ds插入突变株系中出现的曲穗突变体进行表型观察，并扩增Ds侧翼序列进行基因的初步鉴定，在此基础上采用R ACE扩增技术扩增Ds标记基因的cDNA序列，分析Ds的插入对水稻穗型变化影响的分子机理。
1材料与方法1.1材料曲穗突变体水稻来源于水稻品种Dongjin （Oryza sativa L. var. japonica cv.Dongjin）的Ac/Ds插入突变体系，由韩国国立庆尚大学Han Chang-deok教授实验室提供，委托江苏太湖地区农业科学研究所对种子进行播种并栽培。
在生长期期间多次观察其表型，并取田间栽培的野生型与突变体水稻完整植株，带回实验室取其幼嫩的新鲜组织，提取植物基因组DNA和RNA用于后续试验研究。
抽穗期间，突变体较野生型水稻抽穗较早并在该期间株高有显著差异；成熟期，突变体与野生型植株穗弯曲程度存在明显差异（图1）。
1.2方法1.2.1引物设计根据转座子Ds的序列特点，在Ds的3′末端设计引物SP1、SP2、SP3，分别与随机简并引物AD1、AD2搭配，进行TAIL-PCR的3轮扩增；以TAIL-PCR扩增获得的Ds侧翼水稻序列设计3′-RACE扩增特异引物。
水稻株型突变体rad-1和rad-2的鉴定与功能基因克隆
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(11): 1621-1631/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由高等学校全国优博博士学位论文作者专项(6J1153)和中央高校基本科研业务费专项(KYY201301)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 陈赛华, E-mail: saihuachen@, Tel: 025-********第一作者联系方式: E-mail: hongxiaoxd@Received(收稿日期): 2015-04-25; Accepted(接受日期): 2015-07-20; Published online(网络出版日期): 2015-08-05. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20150805.0926.016.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01621水稻株型突变体rad-1和rad-2的鉴定与功能基因克隆牛 静 陈赛华* 赵婕妤 曾召琼 蔡茂红 周 亮 刘 喜 江 玲 万建民南京农业大学作物遗传育种与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095摘 要: 株型是决定水稻等作物产量的核心因素之一, 是品种选育的重要指标。
本研究从粳稻品种Asominori 的辐射诱变中分离出2个稳定的株型突变体, rad-1和rad-2, 它们均表现出苗期弯曲生长、成熟期株高矮化、粒长变短、千粒重降低和产量下降等特征。
等位性测验结合连锁分析证实rad-1和rad-2等位, 且位于水稻第7染色体上约230 kb 的范围内。
对定位区段的序列分析后确定OsFH5为候选基因, 该基因呈现组成型表达, 编码水稻II 型成蛋白。
突变体rad-1在OsFH5基因第2个外显子上缺失8个碱基, 导致移码; 而rad-2则在第14内含子上发生单碱基的变异, 发生异常剪切。
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析水稻卷叶半不育突变体是指在水稻生长过程中，部分叶片出现卷曲现象，并且受粉后能够结实，但结实率较低的突变变异体。
该突变体的形成对水稻的生长发育和产量产生了一定的影响，因此对其进行鉴定和遗传分析具有重要意义。
对水稻卷叶半不育突变体进行鉴定。
鉴定的主要目的是确定该突变体是否为真正的卷叶半不育突变体，而非其他突变体或环境因素引起的异常表型。
鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性测定和分子生物学鉴定。
形态学观察是最常用的鉴定方法之一。
通过观察卷叶半不育突变体的叶片形态、颜色、大小和叶脉等特征，与野生型水稻进行比较，确定其突变性状。
生理生化特性测定可以进一步验证卷叶半不育突变体的特殊性质。
测定叶片中叶绿素含量和光合作用速率，以及花粉的发育和花药的活力等指标，与野生型水稻进行比较分析。
分子生物学鉴定是最直接、准确的鉴定方法。
通过提取突变体和野生型水稻的基因组DNA，利用PCR扩增特定基因片段，进行序列比对和功能分析，确定突变体中是否存在与卷叶半不育相关的突变位点和基因。
除了鉴定，还需要进行初步的遗传分析。
主要的遗传分析方法包括自交系和杂交分析。
自交系分析是通过连续自交突变体将其纯合化，观察其后代表现，推断该特性的遗传方式和基因型。
如果卷叶半不育特性是由一个显性基因控制，自交系分析可以得到比较准确的结果。
杂交分析是通过将卷叶半不育突变体与野生型水稻进行杂交，观察其杂种的表现。
如果卷叶半不育是由一个显性基因控制，杂种的表现应与卷叶半不育突变体相似。
对水稻卷叶半不育突变体进行鉴定和初步遗传分析是研究其形成机制和应用潜力的重要步骤。
通过准确鉴定和细致分析，可以为进一步揭示卷叶半不育的遗传规律和基因功能提供理论依据，并为水稻育种提供重要的遗传资源。
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RMD水稻突变体信息及基因型鉴定1.背景介绍：突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。
植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。
为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。
2.原理：2.1农杆菌介导的T-DNA 插入农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。
1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。
Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。
研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。
T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。
我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。
大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。
由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。
我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。
2.2 水稻Tos17 反转录转座子创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。
这些反转录转座子只有在组织培养条件下才具备转座活性，其中Tos17 的转座活性最强，容易插入到富含基因的区域，因此可以直接用于创造插入失活的突变体库。
利用含有Tos17 插入的水稻突变体库，可以进行突变性状的筛选，T os17 反转录转座子正成为水稻功能基因组研究的一个有力工具。
由于Tos17 反转录转座子为水稻内源的转座子，不需要进行转基因的过程，而且平均每株含有8 个Tos17 个拷贝，在正常情况下能够稳定遗传，因此Tos17 转座子突变体库是水稻功能基因组研究的一个有用资源。
但也有研究表明，Tos17 在转座过程中存在几类转座热点，它容易插入到与抗病相关基因及蛋白激酶基因中。
同时，Tos17 插入突变体库中观察到的突变体大约只有10%的突变是真正由于Tos17插入造成，另外的突变可能是由于组织培养过程中体细胞变异造成的，也有可能是组织培养激活了其它类的转座子发生转座所致。
3.水稻突变体库3.1 水稻突变体库功能由于T-DNA 在植物基因组中能稳定遗传，且拷贝数较低，对于突变体的遗传分析较容易。
加之T-DNA 序列已知，一旦发现某个突变性状与T-DNA 共分离，则采用Tail-PCR、Inverse-PCR 或质粒拯救等方法很容易分离T-DNA 侧翼植物基因组序列。
欲寻找某个基因的突变体，可以设计相应引物，采用Pool-PCR 的方法高通量地筛选突变体库。
另外，通过构建T-DNA 侧翼序列数据库，也可以大规模地寻找基因的突变体。
采用Tail-PCR 的方法分离T-DNA 插入突变体库的侧翼序列，有助于将T-DNA 插入位点在染色体上定位，寻找已知基因不同区段的突变体。
此外，在T-DNA 区段构建Gene trap、Enhance trap 等元件后，还可通过检测报告基因来反映靶位点基因的表达模式。
3.2 遗传转化体系建立农杆菌介导的转化主要依据Hiei（1994）的水稻转化方法并有所改动。
简单流程如下：菌株活化↓愈伤诱导→继代→预培养→侵染→共培养→抗性愈伤筛选→分化成苗→生根→炼苗移栽粳稻品种愈伤组织诱导/继代、预培养/共培养及筛选培养基用N6 培养基，分化和生根用MS 培养基（其成分见附录1）。
3.3 突变体库转化植株的编号为了便于突变体库产生的所有信息如植株种子、T-DNA 侧翼序列、报告基因的表达模式等的统一管理，本研究中水稻突变体库的管理参照统一的数据库管理和编号方法进行，如编号“01Z11AB90”，“01”表示该突变体产生的年份为2001 年；“Z11”表示转化的野生型亲本为中花11 号，中花15 的编号则为“Z15”，“AB”表示不同英文字的组合，代表不同的区号；“90”为阿拉伯数字编号，表示同一小区内的顺序号，编号范围为“01-96”。
3.4 水稻突变体发芽：由于突变体发芽率会普遍降低，我们建议发芽的方法是：首先取10-20粒突变体种子，采用常规催芽的方法，若最后突变体发芽率高于60%的，即可将余下的种子进行常规催芽。
如果发芽率偏低，我们建议您采用组培发芽（具体方法见附录2）。
4．突变体基因型鉴定4.1 载体介绍构建水稻T-DNA突变体库我们一共用过3个载体：pFX，pSMR和pEGFP。
它一样。
T-DNA为图中红线左侧。
载体报告基因pFX GUS&GFPpSMR GUSpEGFP GFP因此，无论是哪个载体，鉴定基因型的步骤都是一样的。
载体左端测序引物：NTLB5 5’ AAT CCA GAT CCC CCG AAT TA 3’载体右端测序引物：PFRB4 5’ TGC AGG TTC TCT CCA AAT 3’4.2 基因型检测的原理如下：对每个插入位点基因设计一对跨T-DNA或Tos17的基因组引物-Sense primer(S)和Antisense primer(AS)，通过这两条基因特异引物(S和AS)与一条载体上已的引物（primer A 或primer B）进行配对扩增，就能确定后代的基因型（见下图）。
1)如果T-DNA或Tos17在某位点的插入是纯合的，当用基因组上一条引物(S或AS)和载体引物进行配对扩增时，能够得到目的条带。
但是由于T-DNA或Tos17的插入使两条基因组引物(S和AS)间距太大，所以用两条基因组引物S 和AS不能扩增出条带；2)如果该位点没有T-DNA或Tos17插入，当用两条基因组引物(S和AS)扩增时能够得到目标条带，但用基因组上一条引物(S或AS)和载体引物配对扩增时不能得到目标条带；3)如果T-DNA或Tos17在某位点的插入是杂合的，则用两条基因组引物(S和AS)以及一条基因组引物(S或AS)和载体引物的配对扩增都能得到目标条带。
pFX-E24.2-15R17741 bpAmp CAM RESISTANCEHYG(R)GFPEGFPBoGUSCAT-1 IntronCatalase intronT BORDER (L)T-BORDER (R)pVS1 StapBR322 bom siteGAL4/VP16pUC oriF1 oriPOLY A SITECAMV35S6xUASpLACpVS1-REPpBR322 ori4.2 引物选择农杆菌T-DNA整合到植物基因组中的位置是随机的，可能出现正向插入和反向插入两种情况，同时我们分离侧翼序列时根据使用引物的不同，会分离到T-DNA左端侧翼序列和右端侧翼序列。
当我们拿到感兴趣的突变体的编号后，如何选择合适的引物组合来进行基因型的鉴定呢？第一步，检查T-DNA的插入方向具体方法是：将突变体的侧翼序列在NCBI上进行比对，比对结果中会出现一个strand值（如下图红框显示）：strand=Plus/ Plus，代表我们分离到的侧翼序列与基因组正义链匹配；Strand=Plus/Minus,代表我们分离到的侧翼序列与基因组反义链匹配；但是，侧翼序列在基因组上的正反向并不能代表T-DNA在基因组上的的插入方向，我们还需要通过分析当初分离侧翼序列时使用的是T-DNA的左端还是右端的引物，来确定T-DNA在基因组上的的插入方向。
第二步，确定侧翼序列是在T-DNA左端还是右端具体方法是：我们的突变体有统一的编号，前缀表示分离的方法等（具体见RMD网站详细介绍），后缀显示的是分离侧翼序列时所使用的引物（见下图红框，测序时即可使用该引物）。
如果我们使用引物NTLB5，代表分离得到的是T-DNA 的左端序列，如果我们使用引物PFRB4，代表分离得到的是T-DNA的右端序列，第三步，T-DNA在基因组上的的插入方向根据第一步和第二步的结论，我们即可确定T-DNA在基因组上的的插入方向，并选择合适的检测基因型的引物（结论见表一）。
分离侧翼序列引物strand=Plus/ Plus Strand=Plus/MinusNTLB5分离反向插入正向插入PFRB4分离正向插入反向插入T-DNA正向插入到基因组中情况：T-DNA反向插入到基因组中情况：第四步，确定引物组合根据第三步的结论，我们可以选择引物组合进行基因型鉴定（见表二）。
表二：分离侧翼序列的引物T-DNA正向插入T-DNA反向插入NTLB5 S+AS/S+NTLB5 S+AS/AS+NTLB5 PFRB4 S+AS/AS+PFRB4 S+AS/S+PFRB4 4.3 举例说明鉴定基因型的步骤：1）用突变体的侧翼序列（可在/查找）和水稻基因组比对（推荐NCBI），找到T-DNA插入位点。
以03Z11AA66为例，其侧翼序列为：>Sequence1|Possible location: Chromosome 3 (by Zhang Jian)CGTCC GCAATGTACTCACCCGGCCTAGCA TACGACCTGCTGCCTGTCTTGAGAACGCC ACGAAGCGGCAGCCTGCATGTCGTTTACG AGGAGCCCTTAGATTCCCCTCCAGAATTA GGAGTACACGCCCTGTGTTGGTGTCGATC AATCGATAATGTAGATTGATCGCAATCGA GATGGGTGTTGATGAGCAGGATCATATCC ATCCTCCTCTTGGGGGTTTCTCTGCAGGC TCCTGACAGACAATGAATGTGTGCACATG ATCAATGCAGATGCGTGCAGCTATCGAAA TCTTGGTTGGTACTTGTCCTGGATGGCTT GATTAGATTGTTAATACCAAAACACATTT TTTCGCTCATACTGATATACGAGTAGTAG TAGGACTTCCTCGTGAGCTCTCTTGAATTCAT CTCACTCGACGA用该侧翼序列在NCBI上做BLAST，结果如右图：由BLAST结果可知以下信息：1.T-DNA插入为点为第三染色体5013391处，2.该家系strand=Plus/ Plus，3.分离侧翼序列的引物为NTLB5（TTL _03Z11AA66 _NTLB5）将2和3结果对应表一得知T-DNA是反向插入在基因组中。