葡萄糖异构酶

葡萄糖异构酶研究概况

摘要：葡萄糖异构酶(glucose isomerase，GI)能催化D—葡萄糖至D—果糖的异构化反应，是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶，目前国内外众多科研机构和企业正在进行葡萄糖异构酶研究和应用。葡萄糖异构酶的研究主要包括菌种的筛选、发酵条件的优化以及酶的固定化生产等方面。

关键字：葡萄糖异构酶菌种分离纯化固定化

一、葡萄糖异构酶简介

葡萄糖异构酶(Gl)又称D-木糖异构酶（D-xylose isomerase），为一种水溶性酶。1957年在嗜水假单胞菌中最早发现了GI，它能催化D一葡萄糖至D一果糖的异构化反应，特别是在果葡糖浆的生产中，是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆(high fructose cord syrup，HFCS)的关键酶，并且该酶还能够将木聚糖异构化为木酮糖，再经微生物发酵后生产乙醇。应用这种酶可以使葡萄长期以来糖浆中90%以上的糖分转化为果精，使甜度大大提高，因而可用淀粉作原料生产出食用性良好的葡果糖浆。为了解决食糖供应不足，六十年代末期以来，葡萄糖异构酶的生产与应用的研究引起了人们的重视。

二、产葡萄糖异构酶的微生物

产葡萄糖异构酶的菌株很多，主要有沙门氏菌、大肠杆菌、枯草杆菌属、葡萄球菌属、链霉菌属及其他菌属。大多数是从土壤中分离出来的。放线菌具有葡萄糖异构酶产量多，酶的热稳定性好等优点，并且在酶反应时不需要添加砷酸盐或锰盐等有毒物质。分离异构酶产生菌，一般采用木糖作唯一碳源，如吉村贞彦等使用D—木糖1%、酵母膏 %、磷酸氮二钾 %、硫酸镁 %、硫酸锰 %和碳酸钙 %组成培养基，在含有10毫升上述培养基的试管中，接入土样。45℃培养24小时，连续富集培养三次，然后于加入2 %琼脂的上述培养中，进行平板分离，移入斜面，再进行摇瓶发酵，测定葡萄糖异构酶活力。

除土壤分离新菌种外，另外对原有菌种进行强烈因子处理。如Bengtson用亚硝基胍或紫外线诱变Streptomyces ATCC 21175能显著提高酶活，经处理的菌种酶活力为518单位/毫升，而不处理的仅有3 18单位/毫升。

三、葡萄糖异构酶发酵条件

碳源对形成葡萄糖异构酶的影响

葡萄糖异构酶是一种诱导酶，一般需要在培养基中加入木糖一类物质，才能促进酶的形成。但木糖价格昂贵，不易实现工业化生产。高崎义幸研究可用麸皮代替木糖进行培养，又用棉籽壳与玉米芯的酸水解物代替木糖也收到好的效果。

Park等认为酸水解玉米芯或麸皮作为诱导剂，能促进酶的形成，而用碱水解却不产酶。高崎义幸指出麸皮浸出液( 100℃，2小时)，在，80℃，用ɑ-淀粉酶处理后能增加S. albu YT4酶活及缩短发酵时间。又认为木二糖比木糖作为诱导物更有效，当培养基有木二糖或木聚糖和木糖共存时，酶活力更显著增加。高崎义幸在培养链霉菌时，添加 %木二糖到含有 %木聚糖的培养基中，，30℃，培养33小时，与不加木二糖相比，酶活力能成倍增长。有些研究者报道在培养基中加人葡萄糖、山梨醇能维持一定pH，同时山梨醇能增加产酶量。

氮源对生产葡萄糖异构酶的影响

高崎义幸认为玉米浆、酪素酸解液及酶解液对链霉菌产生葡萄糖异构酶较合适。多数都采用玉米浆作为氮源，也有使用硝酸铵、磷酸铵等作为氮源。Heady 为促进酶产量，培养 ATCC 21114时，在培养基中加入甘氨酸及硝酸铵，能显著刺激酶活，增加酶量两倍多。

四、葡萄糖异构酶的分离纯化

葡萄糖异构酶的提取

酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。

葡萄糖异构酶主要是胞内酶，可以直接用其菌体，进行反应。提取胞内酶，首先要做的工作就是破碎细胞（细胞壁、细胞膜），然后将含有酶活性的部分用过滤或离心的方法去除残留细胞以及细胞碎片，从而进一步得到澄清的溶液。再采用逐步逐级分离和浓缩等步骤将所得的无细胞提取液纯化。常用破碎处理法：

1、机械破碎法：指利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎开来；

2、物理破碎法：指利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎开来；

3、化学破碎法：指利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变；

4、酶学破碎法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎开来。

纯酶的分离纯化

纤维素离子交换层析

离子交换柱层析粗酶液经过DEAE—纤维素DE—52柱(3x11cm)层析分离，

当上样量使柱饱和后，用含有不同浓度NaCl的摩尔/磷酸钠缓冲液梯度洗脱并收集活力峰，SePhadexG—200柱层析，将离子交换所得活性组分适当浓缩，加至平衡后的SephadexG—200柱(2X10oem)上，Zsonm监测下收集活力峰，圆盘电泳检测为均一带。

SePhadex凝胶过滤

在离子交换柱层析分离的基础上，将所收集的活性组分透析浓缩后，分别在SephadexG—150和SephadexG—200两种介质上进行了分离实验，选用最适柱长及柱内径。

以产酶菌株：玫瑰红336变异株分离纯化为例进行以下阐述：

酶的分离纯化过程：

(l) 酶的抽提：将所制得的丙酮干粉按50 m L/ g 干粉之比加入 mol/L，的磷酸缓冲液，磁力搅拌3 h后离心15min(400 r/min)得上清为粗酶液。若要提高产率，可以进行多次抽提。

(2)DEAE—52 纤维素柱层析：粗酶液直接上DEAE—52 纤维素柱，依次用L 磷酸缓冲液配制的，，， mol/L NaCl溶液 )洗脱，收集 mol/LNaCl溶液的洗脱峰，必要时可再收集 mol/L NaCl洗脱下来的活力峰( 见图1 )。

(3) 硫酸铵分级：将收集的酶液用固体硫酸铁调至饱和度为，在5℃搅拌1h，离心(10000 r/min)得上清后再用硫酸铁调至饱和度为，5℃下搅拌l h 后，离心得有酶活力的沉淀。加 mol/L，磷酸缓冲液溶解后，透析过夜。